冷冻对精子凋亡及印记基因DNA甲基化修饰的长时程效应研究

摘要

精子冷冻保存是男性生殖能力延续的主要技术方法之一,在人类辅助生殖领域和精子库样品保存中应用广泛。据报道,人类精子在冷冻保存28年后成功复苏,并借助辅助生殖技术成功受孕,但我们对担负着繁衍后代重任的精子的要求,绝不仅仅是可以生育这么简单。近年来,越来越多的癌症患者在进行放、化疗前有生殖力保存的愿望,而且在辅助生殖领域,一些少精症或者高位截瘫男性患者,为了实现繁衍后代的目的,必须通过附睾穿刺的方式获得精子(不含精浆)并低温冷冻保存,进一步等待合适的时机借助“试管婴儿”技术孕育后代。伴随着人类精液冷冻技术的广泛使用,其安全性也受到了越来越多的关注。
　　低温冷冻虽然可以延长精子保存时间,但在冷冻过程中冰晶的形成、氧化应激反应以及高溶质引起的溶液效应均有可能造成精子细胞膜、DNA完整性、线粒体功能等方面的损伤,进一步影响到受精能力甚至胚胎质量。表观遗传是一门真正将环境应力与基因遗传联系在一起的学科,指在DNA序列不发生变化的情况下,基因表达却发生了变化,而且这种变化能够在发育和细胞增殖过程中稳定传递。其中DNA甲基化作为表观遗传的重要组成部分,因其发现较早和相对稳定的遗传基础而备受关注。有研究显示,胚胎印记基因的DNA甲基化易受到外界环境因素(温度、渗透压、体外操作等)的影响,而且这种DNA甲基化异常与男性不育以及胎儿印记基因缺陷疾病密切相关,如父源印记基因H19印记控制区域的DNA甲基化修饰异常会引起绒毛滋养层细胞侵润能力下降以及SRS和BWS疾病的高发,母源印记基因KvDMR1也与AS/BWS高发密切相关。目前,国内外鲜有关于人类精子冷冻后的印记基因DNA甲基化修饰的损伤评估。因此,本研究从精子DNA完整性、DNA甲基化修饰两个方面,综合评估精子冷冻的安全性。
　　目的:
　　检测冷冻及冷冻时间长短对精子凋亡以及精子印记基因(父源H19、母源KvDMR1)的印记控制区域(ICR)的DNA甲基化修饰的影响。
　　方法:
　　以15例健康男性精液为研究对象,将每份精液样品除留少许作为对照外,其余分为两部分(每部分又等分为若干份),一部分连同精浆一起进行程序化冷冻,另一部分通过Isolate法去除精浆后冷冻,并分别于冷冻后1个月、3个月、6个月和12个月时,通过亚硫酸氢盐测序PCR的方法分析H19,KvDMR1ICR的DNA甲基化状态。进一步通过流式细胞术检测去除精浆冷冻1个月、3个月、6个月后精子的凋亡情况。
　　结果:
　　1.连同精浆一起冷冻的精子样品,冷冻1个月、3个月和6个月后,父源印记基因H19ICR的DNA甲基化丢失率分别为13.62±2.06％、14.88±1.96%、15.89±2.26%,与对照相比(12.74±2.85%)无显著差异(P>0.05);母源印记基因KvDMR1ICR的DNA甲基化与对照相比无增加,即无显著差异(P>0.05)。
　　2.去除精浆后冷冻的精子样品,与对照相比(H19,12.74±2.85%),冷冻1个月、3个月、6个月后,父源印记基因H19ICR的DNA甲基化丢失率分别为15.24±1.91%(P>0.05)、13.49±2.63%(P>0.05)和30.92±3.08%(P<0.01),母源印记基因KvDMR1ICR的DNA甲基化改变在冷冻12个月内与对照相比无显著差异(P>0.05)。
　　3.进一步对去除精浆冷冻1个月、3个月、6个月的精子样品检测其凋亡情况,结果显示,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
　　结论:
　　在精子冷冻保存过程中,与DNA损伤相比,精子印记基因的DNA甲基化修饰,尤其是父源印记基因,更容易受到影响,而且这种影响表现出一种时间依赖的长时程效应。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

1．精子处理及低温冷冻储存对精子影响的研究现状

2．辅助生殖技术中精子的低温冷冻储存损伤

3．印记基因表观遗传学研究

3.1 表观遗传

3.2 DNA甲基化

3.3 基因组印记

3.4 印记基因H19、KvDMR1的研究现状

正文

实验一 冷冻对精子印记基因DNA甲基化修饰的长时程效性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 冷冻对精子凋亡的长时程效应研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢