3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能鉴定

摘要

目的:传统前列腺癌治疗手段效果不佳,基因治疗有望成为新型高效治疗手段。前期实验已证实针对survivin基因进行RNA干涉能有效促进前列腺癌细胞凋亡,但survivin-siRNA体内递送效率低下和靶向性差的问题依然没能解决,故本课题旨在构建一种高效靶向survivin-siRNA递送系统,用抗PMSA适配子介导靶向,穿膜肽TAT提高递送效率,提高survivin-siRNA在前列腺癌治疗中的特异杀伤效率。
　　方法:构建pET-44b-3TAT-DRBD表达载体,用IPTG诱导融合蛋白3TAT-DRBD表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定。凝胶迁移阻滞实验验证DRBD的siRNA结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力。
　　结果:双酶切和DNA序列测定表明所构建重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD与设计一致;IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白(含Nus标签和S标签)在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白的80％;用凝血酶成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子量约为17000Da;电泳迁移阻滞实验证明融合蛋白3TAT-DRBD能有效结合靶向survivin基因的siRNA(survivin-siRNA),经激光共聚焦显微镜观察在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌细胞的效率明显增高。
　　结论:成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步与适配子连接和功能研究奠定了基础。

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第一部分 3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及纯化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 3TAT-DRBD融合蛋白的初步功能验证

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 SA基因片段合成

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢