大鼠吗啡戒断大麻素信号对伏隔核突触传递调节功能的影响的研究

摘要

奖赏通路在药物成瘾和戒断中发挥了重要的作用。伏隔核(NAc)是这条通路中的一个重要核团。已知,表达于突触前膜的大麻素1型受体(CB1Rs)广泛地分布于NAc上。并且,CB1Rs和NAc一样,也参与了对药物成瘾的调节。早先的研究发现,可卡因间断给药1周后,CB1Rs参与了对纹状体γ–氨基丁酸(GABA)突触的调节。受此启发,我们研究了大鼠在吗啡(MOR)戒断时,CB1Rs对NAc突触的传递调节功能的影响。在本研究中,7天的重复皮下给药(MOR)可以成功地诱导大鼠的条件性位置偏爱(CPP)模型。运用电生理学方法可以看到,CB1Rs激动剂WIN55,212–2对NAc神经元的自发抑制性突触后电流(sIPSC)、微小抑制性突触后电流(mIPSC)以及刺激诱发的抑制性突触后电流(eIPSC)的抑制作用在3天MOR组和3周MOR组中较同时间的生理盐水组(SAL组)明显增强,并且这个增强作用可以被预先灌流的CB1Rs抑制剂AM251阻断。而在5周MOR组和5周SAL组的比较中,这种抑制增强作用消失。用同样方法观察兴奋性突触后电流(EPSCs),结果显示,WIN55,212–2对NAc神经元的自发兴奋性突触后电流(sEPSC)、微小兴奋性突触后电流(mEPSC)以及刺激诱发的兴奋性突触后电流(eEPSC)的影响,与SAL组在3天、3周和5周时比较没有统计学差异(P>0.05)。根据以上结果,我们对比了MOR组和SAL组在3天、3周以及5周时的CPP变化,结果发现,3天MOR组和3周MOR组的大鼠保留了对MOR配对空间的偏爱,而在5周时这种现象消失。由此我们得出结论,在MOR戒断时,大鼠NAc中CB1Rs的含量增多和(或者)功能增强,并且GABA电流的敏化作用是逐渐可逆的。以上结果表明,调节CB1Rs对于治疗阿片类药物成瘾可能具有重要的理论和现实意义。本实验分为四个部分:
　　第一部分:大鼠吗啡戒断模型的建立以及WIN55,212–2实验浓度的确定
　　运用CPP方法,研究人员可以预测人类和动物对成瘾药物的依赖性和渴求性。因此CPP实验是一项被广泛应用于检测药物成瘾的行为学方法。在本研究中,我们应用此法观察7天皮下间断注射MOR是否可以成功诱导大鼠对MOR的偏爱,进而制成稳定的大鼠吗啡CPP模型。结果显示,反复的MOR注射可以成功地诱导大鼠的CPP形成(P<0.05),而用SAL处理的大鼠却没有形成对SAL的偏爱(P>0.05)。因此,通过CPP方法,我们可以成功地建立大鼠MOR戒断模型。
　　为了保证本研究的稳定性和可重复性,我们进行了剂量依赖性实验。我们发现,0.1μM的Win55,212–2对MOR组和SAL组较实验前没有统计学差异(P>0.05)。然而,0.3μM,1μM,2μM,4μM的Win55,212–2能够剂量性地抑制MOR组和SAL组的sIPSC的频率和eIPSC的幅度(P<0.05)。因此,为了保证实验的稳定性并且尽量避免药物的毒性作用,我们选择Win55,212–2的实验浓度为1μM。
　　第二部分:CB1Rs激动剂和抑制剂对NAc中的MSNs的EPSCs的影响
　　已知在NAc神经元中,突触前刺激CB1Rs可以减少谷氨酰胺能神经传递。因此,为了观察谷氨酰胺能传递是否参与了CB1Rs对药物成瘾和戒断的影响,在全细胞记录模式下,我们运用电压钳技术,首先给包含 NAc结构的脑片灌流 bicuculline,分离 sEPSC。接着我们又加入河豚毒素(TTX),分离出 mEPSC。而后,用电刺激包含NAc的脑片,检测了eEPSC的变化情况。
　　Win55,212–2对 MOR组的sEPSC的频率和幅度、mEPSC的频率和幅度以及eEPSC的幅度与SAL组相比,没有统计学差异(P>0.05)。
　　第三部分:CB1Rs激动剂和抑制剂对于NAc中的MSNs的IPSCs的影响以及CPP留存情况
　　在全细胞记录模式下,我们运用电压钳技术,首先给包含NAc结构的脑片灌流NMDA受体拮抗剂APV和非NMDA受体拮抗剂CNQX,分离自发抑制性突触后电流(sIPSC),检测 GABA突触的电生理活性。接着我们又加入 TTX,分离出微小抑制性突触后电流(mIPSC)。而后,用电刺激含NAc的脑片,检测了刺激诱发的抑制性突触后电流(eIPSC)的变化情况。以上所有的电流均可被 GABA受体阻断剂bicuculline阻断。
　　与SAL组相比,Win55,212–2可以显著地降低3天MOR组和3周MOR组的sIPSC的频率、mIPSC的频率和eIPSC的幅度(P<0.05),而这些效果可以被预先灌流的AM251阻断(P<0.05),这意味着GABA能突触对CB1Rs刺激反应性的增加。但是,Win55,212–2对5周MOR组的sIPSC的频率、mIPSC的频率和eIPSC的幅度的抑制作用,与SAL组相比,没有统计学差异(P>0.05)。
　　我们根据实验分组中的时间指标检查了SD大鼠的CPP留存情况。结果显示,3天MOR组和3周MOR组大鼠依旧保留了对造模时MOR配对空间的偏爱(P<0.05)。而5周MOR组的这种现象消失(P>0.05)。
　　第四部分:CB1Rs激动剂对双脉冲比(PPR)的影响以及NAc中MSNs的形态学研究
　　我们运用PPR法确认CB1Rs对NAc的GABA能传递的刺激作用是否为突触前机制。在MOR组和SAL组的大鼠脑片上,将间隔刺激时间设为50 ms,我们发现Win55,212–2对PPR的反应显著增强(eIPSC2?eIPSC1)(P<0.05)。这个实验结果说明了CB1Rs的作用是突触前机制。
　　在本实验中,我们在倒置显微镜下,以大鼠脑解剖图谱为依据,在鼠脑的冠状位上找到并确认了NAc区域。我们通过前联合定位NAc。并且,在NAc的背侧和内侧可以发现大量的MSNs。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 药物成瘾简介

2 NAc与药物成瘾的关系

3 CB1Rs与药物成瘾的关系

正文

实验一 大鼠吗啡戒断模型的建立以及WIN55, 212–2实验浓度的确定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 CB1Rs激动剂和抑制剂对NAc中的MSNs的EPSCs的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 CB1Rs激动剂和抑制剂对NAc中的MSNs的IPSCs的影响以及CPP留存情况

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 CB1Rs激动剂对PPR的影响以及NAc中MSNs的形态学研究

1. 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢