新型有序氟磷灰石晶体对间充质干细胞分化的影响及信号机制研究

摘要

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)具有多向分化潜能,作为种子细胞在组织工程中广泛应用。氟磷灰石晶体(Fluorapatite,FA)中氟离子取代羟基磷灰石中的羟基,作为组织工程修饰材料具有优良潜能。我们利用水热化学方法合成的新型的有序氟磷灰石(Ordered Fluorapatite,OR-FA)晶体表层具有排列规则的晶体结构,类似牙齿中的釉质结构,而无序氟磷灰石(Disordered Fluorapatite,DS-FA)表层则相反,晶体在基底表面无规则排列。我们之前的研究发现,FA对多种细胞有良好的生物相容性,该晶体表层能促进成骨样细胞和脂肪干细胞等向硬组织形成细胞分化,促进后续基质矿化。然而 FA对牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)的分化有何影响?OR-FA和 DS-FA对干细胞分化的影响有怎样的差别?间充质干细胞与内皮细胞共培养时,FA发挥怎样的作用?FA影响细胞分化的机制如何?目前尚无有关这一问题的研究报道。本课题在合成氟磷灰石晶体涂层的基础上,体外培养和接种间充质干细胞以及内皮细胞,重点观察FA对细胞生长和分化的影响,初步探讨FA发挥作用的机制。为探讨氟磷灰石尤其是有序的氟磷灰石晶体表层作为修饰材料或者支架材料应用于硬组织再生工程的潜力,提供参考依据。
　　本实验分为三个部分:
　　第一部分:新型氟磷灰石晶体表层的合成及对牙髓干细胞生长和分化的影响
　　采用水热化学合成法合成有序和无序的氟磷灰石晶体表层,扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)观察表面结构;将牙髓干细胞接种在两种磷灰石晶体层表面,检测牙髓干细胞的生长状态和分化指标:碱性磷酸酶(Alkaline phosephatase,ALP)和四环素荧光染色,茜素红染色及定量分析检测牙髓干细胞的分化,成骨相关基因谱表达分析,以及扫描电镜观察矿化结节的形成。结果发现,FA晶体层尤其是OR-FA表层显著刺激了牙髓干细胞向硬组织形成细胞分化,细胞有明显的ALP染色,四环素荧光染色和茜素红染色。扫描电镜下观察到与细胞基质结合紧密的矿化结节,FA晶体层显著刺激了与分化和矿化相关的基因表达。
　　第二部分:有序氟磷灰石晶体层在脂肪干细胞及与内皮细胞共培养中的影响。
　　首先,观察微血管内皮细胞(Human microvascular endothelial cells, HMVECs)在 OR-FA表面生长状况。检测细胞增殖和细胞周期,扫描电镜观察细胞在材料表面的生长形态,酶联免疫法检测细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的含量。其次,观察脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ASCs)和内皮细胞在OR-FA表面直接和间接共培养时细胞的分化。荧光标记观察两种细胞的生长形态,ALP和茜素红染色及定量分析检测细胞分化。最后,探讨FGF信号途径在脂肪干细胞和内皮细胞共培养中的作用。分别用FGF信号阻断剂和bFGF处理细胞,ALP和茜素红染色及定量分析,western blotting检测骨钙蛋白表达,来分析对细胞分化的影响。结果发现,HMVECs在OR-FA表面生长良好, FA刺激了内皮细胞中bFGF的分泌。ALP和茜素红染色阳性,脂肪干细胞和内皮细胞在FA表面共培养诱导了细胞的分化。细胞染色和western blotting的结果表明FGF信号途径参与了FA刺激干细胞分化的过程。
　　第三部分:有序氟磷灰石晶体和内皮信号促进脂肪干细胞骨向分化机制的初步研究。
　　选取六种矿化相关的信号途径阻断剂,处理接种在FA表面直接和间接共培养的脂肪干细胞和内皮细胞,ALP和茜素红染色及定量分析,western blotting检测骨钙蛋白在细胞中的表达,同时 ELISA检测 FA表面生长的内皮细胞上清液中 EGF的含量。结果提示,WNT和MAK信号途径抑制后,细胞的ALP和茜素红染色显著减弱,骨钙蛋白阴性表达或表达减弱。EGF,PDGF等信号途径抑制后,细胞的ALP和茜素红染色显著增强,骨钙蛋白表达增强。提示了多种信号途径参与了 FA诱导干细胞向硬组织形成细胞方向分化的过程。

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第一部分 新型氟磷灰石晶体表层的合成及对牙髓干细胞生长和分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 有序氟磷灰石晶体表面在脂肪干细胞分化及与内皮细胞共培养中的影响及机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 有序氟磷灰石晶体和内皮信号促进脂肪干细胞骨向分化机制的初步研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢