LncRNA-uc003uxs在缺氧诱导胃癌侵袭和转移中的作用及其机制研究

摘要

背景：
　　随着诊疗技术的进步,早期胃癌患者五年生存率已显著提高,但是伴有淋巴结转移与远处转移的胃癌患者的预后仍然没有改善。目前,胃癌转移已经成为影响胃癌患者的疗效与获得长期生存的关键问题。起初对肿瘤侵袭转移的研究往往局限于肿瘤细胞内部基因表达的改变而忽略了肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作用。缺氧是实体肿瘤发展过程中重要的微环境之一,不仅可促进肿瘤众多恶性表型的发生,也可诱导下游众多基因的表达发生改变,从而促使新生血管的生成和抗凋亡能力的形成,以及促进肿瘤侵袭和转移的发生。因此,我们决定对缺氧诱导的信号通路进行研究,力图寻找到能有效逆转肿瘤侵袭和转移的分子靶点,为临床上阻止胃癌侵袭和转移的治疗提供充分的理论依据。
　　长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,能在多个层面调控基因表达,是当下肿瘤研究的热点。已有不少文献证实 lnc RN As在肿瘤的侵袭和转移的过程中起着举足轻重的作用。因此,对 lnc RN As在缺氧肿瘤中的作用及机制进行研究,将有助于我们阐明缺氧诱导胃癌侵袭转移的过程及分子机制。
　　目的:
　　1.前期通过高通量lncRN A芯片筛选出5个与缺氧相关的差异性表达的重点lncRNA分子;
　　2.对其中关键的lncRNA的表达进行验证并探讨其在胃癌组织中的表达与在癌旁中的表达水平的相关性;
　　3.进一步探讨关键性 lncRNA在缺氧诱导的胃癌细胞侵袭和转移的过程中的作用及分子机制。
　　方法:
　　1.SGC7901,MKN28,MKN45三种胃癌细胞系,分别经常氧和缺氧孵育24h后,用提RNA试剂盒提取3例配对的胃癌细胞的总RNA,通过高通量lncRNA芯片分析比较它们之间表达的差异。
　　2.通过对邻近编码基因信息的分析、差异倍数的分析和长度特征的分析等条件初步筛选出与缺氧诱导的胃癌细胞侵袭和转移相关的关键分子。
　　3.用实时定量PCR方法检测lncRNA-uc003uxs在常氧条件下的表达水平(相对于缺氧条件下);并进一步检测其在20例胃癌临床标本中的表达水平(相对于癌旁组织)。
　　4.通过构建siRNA慢病毒,稳定下调uc003uxs在SGC7901及MKN28中的表达。通过Transwell实验、裸鼠尾静脉注射等体外与体内实验检测抑制uc003uxs的表达后对常氧和缺氧条件下胃癌细胞的侵袭和转移能力的影响。
　　5.通过生物信息学预测uc003uxs的靶基因,利用实时定量PCR实验和Western Blot实验检测下调uc003 uxs的表达后对靶基因的影响。
　　6.通过免疫组织化学实验检测上述靶基因在胃癌和癌旁组织中的表达情况。
　　7.构建SERPINE1正义表达载体和siRNA载体,并将其转染进入细胞 SGC7901和MKN28中,通过western blot实验检测其表达量的变化,通过Transwell实验检测常氧条件下SERPINE1对胃癌细胞侵袭和转移的影响。
　　8.在 uc003uxs表达稳定下调的细胞株 SGC7901-siuc和MKN28-siuc中转染SERPINE1正义表达载体,通过western blot实验验证后,再利用Transwell实验检测常氧条件下SERPINE1在uc003uxs介导的胃癌细胞的侵袭和转移中的作用。
　　9.通过western blot实验检测在缺氧诱导下,下调 uc003uxs的表达后对SERPINE1蛋白表达的影响。再通过Transwell实验进一步探索SERPINE1是否参与了缺氧诱导下的胃癌细胞的侵袭和转移。
　　10.缺氧诱导下在uc003uxs表达稳定下调的细胞株SGC7901-siuc和MKN28-siuc中转染SERPINE1正义表达载体,利用Transwell实验检测在缺氧诱导下胃癌细胞的侵袭和转移能力的变化,从而探索和了解SERPIN E1在uc003 uxs介导的缺氧诱导下的胃癌细胞的侵袭和转移中的作用。
　　结果:
　　1.前期经过高通量 lncRNA芯片分析对缺氧诱导的胃癌细胞 MKN28、MKN45和SGC7901和常氧条件下孵育的细胞进行比较,筛选出5个在缺氧诱导的胃癌细胞中表达显著上调(P<0.05)的lncRNA分子。
　　2.综合多重条件进一步分析提示uc003 uxs可能是缺氧诱导的胃癌细胞发生侵袭和转移的关键长链非编码RNA分子之一。
　　3.实时定量PCR结果显示: uc003 uxs在缺氧诱导的胃癌细胞中表达显著上调,其分别在MKN28缺氧24h,MKN45缺氧48h,SGC7901缺氧24h时达到峰值。进一步进行PCR结果发现,uc003 uxs在胃癌组织中的表达水平明显高于其在癌旁组织中的表达。
　　4.在常氧条件下,干扰uc003uxs的表达后,细胞MKN28和SGC7901的侵袭和迁移能力显著下降。缺氧诱导下的Transwell实验结果证实缺氧能够显著增加MKN28和SGC7901的侵袭和迁移能力,而干扰uc003 uxs的表达后,缺氧诱导下的胃癌细胞的侵袭和迁移能力也明显下降。
　　5.通过进行生物信息学分析发现,在 uc003 uxs下游3.6kb处有与转移相关的基因SERPINE1(纤溶酶原激活抑制物1)。实时定量PCR和Western Blot实验结果显示下调uc003uxs的表达后,SERPINE1的mRNA和蛋白表达量也显著下调。
　　6.免疫组织化学结果显示SERPIN E1在胃癌组织中的表达明显高于其在癌旁组织中的表达,在发生了远处转移的胃癌原发灶中的表达显著高于其在未发生转移的胃癌原发灶中的表达。通过对 SERPIN E1与胃癌病人的临床参数进行对比分析后得出,SERPINE1与胃癌病人的侵润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关,但与病人的性别,年龄及分化程度并无关联。
　　7.下调SERPINE1的表达后与对照组细胞相比较,MKN28和SGC7901的侵袭和迁移能力明显下降,而上调SERPINE1的表达后,MKN28和SGC7901的侵袭和迁移能力明显增强。
　　8.常氧条件下,在稳定下调uc003uxs表达的细胞系中过表达SERPINE1后,与对照组细胞(MKN28-siuc和SGC7901-siuc)相比,在上调了SERPINE1的表达后,胃癌细胞的侵袭和转移能力因此发生了逆转。
　　9.Western Blot实验结果表明,SERPINE1在缺氧诱导的胃癌细胞中表达明显上调,而经过干扰uc003uxs的表达后,SERPINE1在缺氧诱导下上调的表达趋势消失。进一步进行了缺氧诱导下的Transwell实验,结果显示干扰SERPINE1的表达后,缺氧诱导下的胃癌细胞的侵袭和迁移能力均明显下降。这说明 SERPIN E1参与了缺氧诱导下的胃癌细胞的侵袭和转移。
　　10.缺氧诱导下,在稳定下调uc003uxs表达的细胞系中过表达SERPINE1后,与对照组细胞(MKN28-siuc和SGC7901-siuc)相比,上调SERPINE1的表达后,缺氧诱导的胃癌细胞的侵袭和转移能力因此发生了逆转。这说明SERPIN E1参与了uc003 uxs介导的缺氧诱导的胃癌细胞的侵袭和转移。
　　结论:
　　1.经过我们前期的lncRN A芯片对比分析,筛选出5个与缺氧相关的重点长链非编码RNA分子。
　　2.uc003 uxs是这些分子中影响缺氧诱导胃癌细胞侵袭转移性状的关键性长链非编码RNA分子之一。
　　3.SERPINE1是uc003uxs的功能性靶基因;SERPINE1也可以促进缺氧诱导的胃癌细胞的侵袭转移。
　　4.uc003uxs至少部分通过正性调节SERPINE1来促进缺氧诱导的胃癌细胞的侵袭转移。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、肿瘤转移的研究现状

二、缺氧与肿瘤的侵袭转移

三、长链非编码RNA(lncRNA) 与肿瘤的研究现状

第一部分 胃癌细胞中与缺氧相关的分子lncRNA-uc003uxs的筛选和验证

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 LncRNA–uc003uxs在缺氧诱导的胃癌侵袭和转移中的表型研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 LncRNA–uc003uxs靶基因的筛选，验证及研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 SERPINE1参与lncRNA–uc003uxs调控缺氧诱导胃癌细胞的侵袭和转移的研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢