NDRG2调控VHL/HIF信号通路抑制肾癌细胞增殖及转移的实验研究

摘要

研究背景:
　　肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞,具有不同的病理类型;大多数肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌。肾癌的治疗主要依靠外科手术切除,其对放疗和化疗均不敏感,因此伴发转移肾癌的治疗存在着一定困难。因此,肾癌的生物治疗正日益受到重视。
　　Von Hippel Lindau(VHL)基因是重要的肿瘤抑制基因。人类 VHL基因全长约l5kb,包含有3个外显子(Exon)、2个内含子(Intron)。VHL基因常常发挥抑制肾癌发生、发展的功能;VHL基因的缺失是家族性肾癌的重要诱发因素,而且80％散发的透明细胞肾细胞癌存在VHL基因的缺失或突变。大多数肾细胞癌都存在着VHL基因的缺失或者突变。VHL基因编码213个氨基酸,当完全翻译213个氨基酸时即产生30KD的蛋白质(pVHL30);当翻译从54号密码子开始时,则产生另一分子量为19KD的蛋白质(pVHL19),这两者统称为pVHL。pVHL包含2个结构域,α结构域和β结构域。α结构域司职与Cullin-2,Rbx1,NEDD,转录因子Elongin的调节亚单位B和C(Elongin B和Elongin C)组成E3泛素连接酶复合体,β结构域负责与缺氧诱导因子-α(HIF-α)结合。当E3泛素连接酶复合体与HIF-α结合后,便发挥蛋白酶活性,将HIF-α降解。当pVHL缺失时,HIF-α蛋白变得更加稳定,进而发挥促癌的作用。HIF-α家族包括3个成员,HIF-1α,HIF-2α和HIF-3α。其中,HIF-1α在肾癌的发生、发展、转移及耐药性中的作用正日益受到重视。很多研究表明肾癌中存在HIF-1α的过度表达。HIF-1α是具有转录活性的核蛋白,具有相当广泛的靶基因谱,其中包括与缺氧适应、炎症发展及肿瘤发生等相关的靶基因。在常氧条件下,HIF-1α通过羟基脯氨酸残基与pVHL结合,并被pVHL泛素化,最终导致HIF-1α降解。在低氧条件下,HIF-1α未被羟基化,从而逃脱了 pVHL介导的降解过程。HIF-1α与HIF-1β形成有功能的转录因子;该转录因子可与DNA结合从而调节细胞增殖,转移和血管生成相关的基因。
　　N-myc下游调节基因2(NDRG2),是NDRG家族的一员,是一种新发现的肿瘤抑制基因。研究表明NDRG2的表达在多种肿瘤中,包括肝癌、胰腺癌、脑膜瘤及前列腺癌等均是下调的。我们的前期研究显示NDRG2的表达水平可以被p53上调,同时NDRG2的上调引起了VEGF和HIF-1α表达的下调。并且,我们也发现NDRG2在透明细胞肾细胞癌组织中的表达明显低于正常肾脏组织,通过上调肾透明细胞癌细胞系中NDRG2的表达可以明显抑制其增殖,促进肿瘤细胞凋亡。以上结果表明,抑癌基因NDRG2在肾癌的发生、发展中发挥了重要的作用。对于NDRG2在肾癌中作用的研究可能为肾癌的治疗提供新的思路。
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)源于中胚层,是在多种组织脏器中存在的成体干细胞。目前,能够从骨髓、脂肪、羊水及脐带血中分离和制备间充质干细胞。目前,对于肿瘤发生、发展分子机制的研究不断深入,肿瘤基因治疗不断取得突破。肿瘤的基因治疗相对于传统的外科治疗(Surgical therapy)、放射治疗(Radiotherapy)及化学治疗(Chemotherapy)拥有其潜在的优势,但是目前肿瘤基因治疗在长期稳定表达目的基因等方面存在缺陷,从而使治疗效果大打折扣,治疗的效果无法令人满意。另外,病毒载体介导的基因治疗还存在着基因整合及基因突变的风险。所以,寻求一种拥有良好靶向性并且稳定持久表达目的基因,同时对人体副作用小的治疗载体成为当下肿瘤基因治疗研究的热点。
　　目的：
　　比较NDRG2、pVHL、HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达,研究NDRG2与pVHL、NDRG2与HIF-1α及NDRG2与HIF-2α表达的相关性。探讨NDRG2抑制肾癌细胞增殖及转移的分子机制,为肾癌的靶向治疗提供理论基础。通过携带NDRG2的腺病毒载体感染BMSCs,以观察基因修饰对BMSCs生物学特性的影响。为进一步研究BMSCs应用于肾肿瘤的靶向治疗奠定基础。
　　方法：
　　1.NDRG2、pVHL、HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达及相关性研究1.1免疫组织化学法检测NDRG2、VHL、HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达1.2免疫组织化学法结果的判定免疫组化染色的程度和范围通过半定量发分析。根据细胞浆的染色及染色细胞所占的百分率进行评价。不着色:0分,淡染色:1分,适中染色:2分,深染色:3分。染色细胞百分率<5%:评分为0分,5%至25%:评分为1分,26%至50%:评分为2分,51%至75%:评分为3分,>75%:评分为4分。染色得分与染色细胞百分率得分各自相乘,即为阳性染色系数。阳性染色系数为:0分为:阴性(-),弱阳性为1至4分(+)阳性为5~8分(++),强阳性(+++)为8～12分,采集图片时取典型视野进行拍照。
　　2.NDRG2调控HIF-1α抑制肾癌细胞增殖、转移及VEGF分泌的细胞学研究
　　2.1 Western-blot检测Ad-NDRG2感染后细胞中NDRG2表达的变化
　　2.2 MTT检测NDRG2对CaKi-1增殖的影响取对数生长期的CaKi-1细胞,以5×103个/孔接种在96孔板中,每板接种5孔。以40MOI的Ad-NDRG2和Ad-LacZ孵育2小时。换以新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640继续在37℃饱和湿度下常规培养。感染病毒后分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h取出1块96孔板,每孔加入MTT溶液后将96孔板置于37℃孵箱孵育4 h,弃上清。每孔加入150μl的DMSO充分振荡10min至结晶完全溶解。读取490 nm波长测定吸光度值。
　　2.3 Transwell检测NDRG2对CaKi-1侵袭和迁移的影响铺被 Matrigel的小室用于侵袭实验,未铺被 Matrigel的小室用于迁移实验(Matrigel购于美国BD公司)。细胞被胰酶消化后以无血清培养液重悬细胞,细胞浓度2.5×105/小室接种于 Transwell小室底部膜的上室面。感染复数40MOI的Ad-LacZ和Ad-NDRG2分别被加至各自组小室内。含有10%小牛血清的培养基被加于小室的下室。常规培养24h后去除小室上室内细胞。以95%的酒精固定小室下室面细胞,吉姆萨(Giemsa)染液染色10min,PBS冲洗后常温干燥。每个小室随机选10个视野光镜下拍照,取平均值进行统计。
　　2.4平板克隆形成试验
　　2.5 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡
　　2.6形态学观察NDRG2对CaKi-1细胞的影响
　　2.7细胞划痕实验取对数生长期的CaKi-1细胞,以5×105个/孔接种在六孔板中,当细胞到达80%密度时,去除培养液,加入无血清RPMI-1640培养液混匀的Ad-NDRG2和Ad-LacZ孵育2小时,再换以新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640继续在37℃饱和湿度下常规培养12h。以细胞刮刀在培养板底面划直线痕。沿划痕选取10处位置并做好标记,继续常规培养48h。分别于培养12h,24h和48h拍照并测定划痕两侧细胞迁移距离,取平均值进行统计。
　　2.8 Western-blot检测NDRG2对CaKi-1细胞中HIF-1α、VEGF表达的影响
　　2.9间接免疫荧光检测NDRG2对CaKi-1细胞中HIF-1α、VEGF表达的影响取对数生长期的CaKi-1细胞接种在六孔板中,当细胞到达80%密度时,去除培养液,加入无血清RPMI-1640培养液混匀的Ad-NDRG2和Ad-LacZ孵育2小时。再换以新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640继续在37℃饱和湿度培养24h。取出六孔板,加入4%多聚甲醛处理(室温)20min;PBS漂洗。加入0.5%Txiton X-100处理(室温)20min;3%H2O2处理(室温)15min;切片置0.01mol/L柠檬酸缓冲液中煮沸15min,然后自然冷却20min;滴加封闭液,常温封闭20min。滴加1:1000稀释后小鼠抗人NDRG2、HIF-1α和VEGF单克隆抗体,4℃孵育24h,滴加荧光素(FITC和Cy3)标记兔抗鼠二抗,37℃孵育30min,缓冲甘油封片,荧光显微镜下拍照。
　　2.10 ELISA检测NDRG2对CaKi-1细胞分泌VEGF的影响取对数生长期的CaKi-1细胞,以5×105个/孔接种在24孔板中,每板接种5孔。待细胞完全贴壁去除培养液,加入无血清RPMI-1640培养液混匀的Ad-NDRG2和Ad-LacZ孵育2小时。换以新鲜的含10%胎牛血清的RPMI-1640继续在正常氧条件(37℃,5%CO2,20%O2,75%N2)和缺氧条件(1%O2,5%CO2和94%N2)培养24h。根据ELISA说明书,用酶标仪在450nm测定光密度值(OD:optical density)。
　　3.NDRG2通过上调pVHL表达并降低HIF-1α和VEGF表达抑制肾癌细胞在裸鼠体内增殖的实验研究
　　3.1裸鼠体内生长抑制实验30只6周裸鼠均购于我校实验动物中心。各实验步骤均按照我校实验动物伦理委员会的规定进行。无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)级饲养室常规饲养1周后进行试验。取对数期生长的CaKi-1细胞(5×106 cells),皮下注射于6周龄裸鼠左下腹。取30只皮下肿瘤达到200mm3的裸鼠,随机分成三组:Control组、Ad-LacZ组和Ad-NDRG2组各10只。每3天进行瘤内注射(1×109 pfu溶解于100μl的PBS),共注射7次。以游标卡尺测量肿瘤的长(a)和宽(b);肿瘤体积计算公式为V=ab2/2。每天监测实验动物的生存状况,记录裸鼠的生存时间。当裸鼠出现恶病质(极度消瘦,虚弱,疲劳,行动迟缓,食物摄入量大幅减少和腹水)时通过颈椎脱臼法处死,所有裸鼠的处死过程均采用小鼠痛苦程度最小的处死方法,麻醉裸鼠剂量为(130 mg氯胺酮+8.8 mg甲苯噻嗪/kg体重)。从荷瘤鼠身上切除肿瘤并将肿瘤组织固定于10%中性甲醛中,固定24h后进行石蜡包埋及之后的免疫组化实验。
　　3.2免疫组织化学法检测NDRG2、pVHL、HIF-1α和VEGF在荷瘤鼠肿瘤组织中的表达。
　　4.间充质干细胞的分离、培养、鉴定及肾肿瘤趋向性的研究。
　　4.1SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养及鉴定。
　　4.2MTT检测BMSCs细胞增殖的能力。
　　4.3Transwell检测BMSCs向肾肿瘤细胞的趋向性。
　　4.4间接免疫荧光实验检测NDRG2基因修饰对BMSCs细胞表面标志物的影响4.5 Transwell检测NDRG2基因修饰对BMSCs肾肿瘤细胞趋向性的影响。
　　结果：
　　1.NDRG2、pVHL、HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达及相关性研究。
　　NDRG2在肾透明细胞癌组织中阳性表达率(30.0%)明显低于在正常肾脏组织中的阳性表达率(60.0%)(P<0.01)。pVHL在肾透明细胞癌组织中阳性表达率(26.9%)明显低于在正常肾脏组织中的阳性表达率(66.2%)(P<0.01)。相反,HIF-1α在肾透明细胞癌组织中阳性表达率(55.4%)明显高于在正常肾脏组织中的阳性表达率(33.7%)。
　　3.2 裸鼠生存曲线Control组和Ad-LacZ组荷瘤鼠生存时间明显小于Ad-NDRG2组裸鼠(P＜0.01)，而Control组和Ad-LacZ组裸鼠生存时间无显著性差异。
　　3.3 免疫组织化学染色Ad-NDRG2组荷瘤鼠肿瘤组织中NDRG2和pVHL表达水平明显高于Control组和Ad-LacZ 组。但是，Ad-NDRG2 组荷瘤鼠肿瘤组织中 HIF-1α和VEGF 表达水平明显低于Control组和Ad-LacZ 组。ImagePro Plus 软件分析显示：Ad-NDRG2组NDRG2和pVHL的IOD值明显高于Control组和Ad-LacZ组；而Ad-NDRG2组HIF-1α和VEGF的IOD值明显低于Control组和Ad-LacZ组。Control组和Ad-LacZ组无统计学差异。
　　4.间充质干细胞的分离、培养、鉴定及肾肿瘤趋向性的研究
　　4.1我们运用密度梯度离心法获得了BMSCs，并成功培养于10%FBS的L-DMEM培养液；间接免疫荧光实验显示BMSCs细胞CD34和CD45为阳性；而CD44和CD90为阴性。经14天的成脂诱导及 25天的成骨诱导，细胞显示油红O染色及茜素红染色均阳性。
　　4.2 MTT实验显示 P0 代BMSCs的增殖能力较弱，但当 BMSCs 传代至第三代时BMSCs的增殖能力明显增加，P3 代 BMSCs 与 P6 代 BMSCs 增殖水平无明显差异。
　　4.3 Transwell 检测空白对照组穿入下室面的细胞数（15.6±4.60）和HEK293组穿入下室面的细胞数（16.1±4.42）明显少于 CaKi-1组（42.4±5.71），（P＜0.01）。
　　4.4间接免疫荧光实验显示 NDRG2基因修饰对BMSCs 细胞表面标志物无影响。
　　4.5Transwell检测显示NDRG2基因修饰对BMSCs肾肿瘤细胞趋向性无影响。
　　结论：
　　1.NDRG2和pVHL在肾透明细胞癌组织中阳性表达率均明显低于在正常肾脏组织中的阳性表达率。相反，HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌组织中阳性表达率明显高于在正常肾脏组织中的表达水平。并且，NDRG2与pVHL 表达呈正相关，而NDRG2与HIF-1α和HIF-2α表达呈负相关。
　　2.NDRG2对CaKi-1细胞增殖、侵袭和迁移有明显的抑制作用。
　　3.NDRG2可以降低HIF-1α和VEGF的表达水平，并可以抑制CaKi-1细胞分泌VEGF的能力。
　　4.NDRG2 可以抑制CaKi-1细胞在裸鼠体内的增殖能力，并可以延长CaKi-1细胞荷瘤鼠的生存时间。
　　5.NDRG2可以提高CaKi-1细胞荷瘤鼠所成肿瘤中pVHL的表达，同时降低HIF-1α和VEGF的表达。
　　6.NDRG2基因修饰对间充质干细胞的细胞标志物及肾肿瘤趋向性无影响；间充质干细胞可以作为肾肿瘤基因治疗的载体。

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中文摘要

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前言

文献回顾

正文

第一部分 NDRG2、pVHL、HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达及相关性研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 NDRG2调控HIF-1α抑制肾癌细胞增殖、转移及VEGF分泌的细胞学研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 NDRG2通过上调pVHL表达并降低HIF-1α和VEGF表达抑制肾癌细胞在裸鼠体内增殖的实验研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四部分 间充质干细胞的分离、培养、鉴定及肾肿瘤趋向性的研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢