STAT3-Hif1α信号通路抑制剂及其在抗肿瘤中的应用

摘要

本发明公开了一种STAT3-Hif1α信号通路抑制剂及其在抗肿瘤中的应用。该化合物结构通式如式I，R1和R2选自氨基、C1-6的烷基氨基，C5-7的芳基，C5-10的杂环芳基、C6-10的芳胺基中的一种；其中，杂环芳基选自吡咯基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃、吲哚基、苯并咪唑基和苯并噻唑基中的一种，n为2或3；X为氧原子。本发明克服了目前p-STAT3/Hif1α信号传导通路抑制剂在抑制效率、广谱性、毒性等方面存在的问题。本发明可优先用作抗癌药物分子以及发展相关的治疗方法。依据本发明制备的抗癌药物分子可表现出高效率、低毒性、同时作用多靶点、适用范围广的优越性能。式I

说明书

技术领域

本发明涉及STAT3-Hif1α信号通路抑制剂及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术

p-STAT3和Hif1α在癌症、心血管疾病的发生、发展过程中具有极其重要的作用(STAT3：A multifaceted oncogene.David E.Levy and Giorgio Inghirami，PNAS，2006，Vol.103，p10151-10152；Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth.Adrian L.Harris，Nature Reviews Cancer，2002，Vol.2，p38-47)。这两条信号传导途径均牵涉到多种细胞激素与生长因子，其异常活化可以导致在包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、淋巴癌与白血病等多种癌症(Targeting HIF-1 for cancer therapy.GL.Semenza，Nature ReviewsCancer，2003，Vol.3，p721-732)。而VEGF、RLN等细胞激素的异常表达，会造成成纤维细胞分化、扩增异常，进而引发高血压、心律失常等心血管相关疾病(Increased myocardial collagen and ventricular diastolic dysfunction inrelaxin deficient mice：a gender-specific phenotype.Du XJ，Samuel CS，Gao XM，ZhaoL，Parry LJ，et al.Cardiovascular Research，2003，Vol.57，p395-404.)。

STAT3蛋白在细胞内的磷酸化水平受到其上游的生长因子受体(EGFR)、细胞激素受体(ILRs)、部分酪氨酸激酶(Src)等蛋白调控。正常条件下，这些上游蛋白处于去磷酸化或去活化状态，不能与STAT3发生相互作用。当这些受体受各种条件影响，在自身被磷酸化或招募JAK类激酶，产生酪氨酸激酶活性时，可以结合STAT3，并将其磷酸化成为pSTAT3。磷酸化的p-STAT3会发生二聚，二聚化的pSTAT3可以进入细胞核，改变多种下游基因(如VEGF、Bcl2、cMyc等)的转录、表达水平，诱使细胞发生病变。

Hif1α的合成受到PIK3信号通路以及MEK信号通路的调节。正常条件下，Hif1α上的三个氨基酸残基(P402、P564、N803)会被很快的羟基化，阻断CBP蛋白与Hif1α的结合作用。失去CBP保护的Hif1α很快会进入泛素降解途径而分解。因此普通细胞中，Hif1α的转录激活能力很低。在肿瘤组织中，普遍存在组织缺氧条件，这时Hif1α不会发生羟基化过程，因此CBP可以有效保护Hif1α，提高其活性，从而激活VEGF、GluT1等促营养基因的转录，为肿瘤组织的快速生长提供条件。

有部分证据显示，STAT3和Hif1α信号通路间存在调节关系。在乳腺癌MCF-7中，可以观察到，p-STAT3通过活化Akt信号通路，提高Hif1α表达的现象，然而从p-STAT3到Hif1α的信号通路是否在多种癌细胞系广泛存在仍有疑问。另一些实验表明，p-STAT3和Hifa可以在细胞内形成异源二聚体，这种异源二聚体能够起到直接活化VEGF转录的作用(STAT3 is a potential modulator of HIF-1-mediated VEGF expressionin human renal carcinoma cells.J.Jung，H.Lee，I.Cho，D.Chung，S.Yoon，Y.Yang，J.Lee，S.Choi，J.Park，S.Ye and M.Chung，The FASEB Journal，2005，Vol.19，p 1296-1298.)。基于上述认识，可以预想，如果药物能够同时抑制p-STAT3与Hif1α信号通路，其抗癌活性必将有极大提高。

目前，针对抑制这两条信号通路，已经有多种可能的活性药物被开发出来。这些药物大体可以分为三类：蛋白/多肽类(FIH-1：a novel protein that interacts withHIF-1 alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity.PC.Mahon，K.Hirota，GZ.Semenza，Genes Dev，2001，Vol.15，p2675-2686.)；寡聚核苷酸类(T40214/PEIcomplex：A potent therapeutics for prostate cancer that targets STAT3signaling.P.Weerasinghe，Y.Li，YL.Guan，R.Zhang，DJ.Tweardy and NJ.Jing，The Prostate，2008，Vol.68，p1430-1442)；小分子化合物。然而，多肽类药物往往存在易被降解的问题；寡聚核苷酸则在跨膜运输上存在困难，而且二者均必须直接注射入循环系统才能起到药效，其有效形式不可能通过消化系统被吸收。与生物大分子药物相比，具有良好水溶性的小分子药物能够更为高效的被吸收、组织输送，通过跨膜运动进入癌细胞。因此，开发直接可溶于水的小分子药物越来越受到抗癌领域的关注。遗憾的是，目前尚未有能够同时靶向p-STAT3、Hif1α两条信号通路的小分子药物出现。

二萘嵌苯类分子最早作为一类红色染料分子被合成出来(专利：Aromatictetraacarboxylic acid diimide dispersing agents for pigments in paints.Miki，Toshiyuki；Takeya，Mitsumasa.From U.S.(1988)，US 4762569 A 19880809.Synthesis and propertiesof fluorescent bis-quatemized perylene dyes.Deligeorgiev，T.；Zaneva，D.；Petkov，I.；Timcheva，Il.；Sabnis，R.Dyes and Pigments 1994，Vol.24，p75.)。随后在1998年，二萘嵌苯类分子被指出可以通过结合到端粒G-四联体上，而具有端粒酶抑制剂活性(NMR-Based Model of a Telomerase-Inhibiting Compound Bound to G-Quadruplex DNA.Fedoroff，O.Y.；Salazar，M.；Han，H.；Chemeris，V.V.；Kerwin，S.M.；Hurley，L.H.Biochemistry 1998，Vol.37，p12367.New perylenetetracarboxylic acid diimide andcarbocyanine compounds，useful as telomerase inhibitors for treating，e.g.cancers orinfections or as contraceptives.KERWIN，S.M；FEDOROFF，O.Y；SALAZAR，M；HURLEY，L.H.(1999)，WO9940087-A.)。然而，迄今为止，还没有关于二萘嵌苯衍生物分子作为STAT3-Hif1α信号通路抑制剂的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种STAT3-Hif1α信号通路抑制剂及其在抗肿瘤中的应用。

该STAT3-Hif1α信号通路抑制剂，也即式I所示二萘嵌苯衍生物，

式I

所述式I中，R₁和R₂选自氨基、C_1-6的烷基氨基，C_5-7的芳基，C_5-10的杂环芳基、C_6-10的芳胺基中的一种；其中，所述杂环芳基选自吡咯基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、苯并噻吩基、苯并呋喃、吲哚基、苯并咪唑基和苯并噻唑基中的一种；

n为2或3；

X为氧原子。

具体的，所述R₁和R₂均为1-N杂环己烷基或氨基或N，N-二甲基胺基或

所述式I所示化合物具体为如下式1至式10任一所述化合物：

式1

式2

式3

式4

式5

式6

式7

式8

式9

式10

本发明制备式I所示化合物的方法，包括如下步骤：将3，4，9，10-二萘嵌苯四甲酸二酐与末端取代有含氮基团的伯胺于有机溶剂中混匀进行回流反应，反应完毕得到所述式I所示化合物。

上述方法中，所述末端取代有含氮基团的伯胺为乙二胺、3-(1’-哌啶基)-1-丙胺、丙二胺或N，N-二甲基-1，3丙二胺；

所述3，4，9，10-二萘嵌苯四甲酸二酐与伯胺的投料摩尔比为1-2至1-4，具体为1∶2.5；

所述反应步骤中，时间为2-8小时，优选4小时；

所述有机溶剂选自正丁醇、四氢呋喃和异丙醇中的至少一种；

所述有机溶剂的用量为每克固体原料用20-100mL所述有机溶剂溶解，优选每克固体原料用50mL所述有机溶剂溶解。

式I所示化合物作为p-STAT3以及Hif1α信号传导通路抑制剂的应用及在抑制p-STAT3以及Hif1α信号传导通路中的应用及在制备抗肿瘤药物中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述肿瘤为前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌或淋巴癌。

本发明人在长期研究后，发现了式I所示二萘嵌苯衍生物，具有良好的水溶性、高效率的抑制活性和较低的毒性，是一种新型的p-STAT3以及Hif1α信号传导通路抑制剂。

随后通过免疫印迹方法，筛选对p-STAT3、Hif1α具有较高生物活性的小分子。在获得对p-STAT3、Hif1α蛋白表达水平有实际影响的小分子后，继续通过免疫印迹方法，检测p-STAT3、Hif1α上游及下游各基因表达情况，以确定小分子的粗略调控位置。同时测定其它信号传导途径是否受到影响，以判断小分子的专一性。

初步确定小分子的作用基因后，通过定量RT-PCR的方法，确定小分子的直接作用位置是发生在转录水平还是表达水平上的。同时测定部分下游基因的转录情况，以进一步确信小分子的作用基因。

在确定小分子的直接作用位置后，通过SPR，GST-pull down等分子分析方法，确定小分子与靶点的直接作用。至此，即可通过实验判明小分子的作用机理。

为了辅助论证小分子的作用机理，通过分子模拟计算的方法，推测小分子的具体作用模式以及作用位置细节。

在判明小分子的药理作用后。通过免疫印迹、MTT等方法，考察小分子对不同癌细胞系的调控目标蛋白表达以及促凋亡能力。之后，采用裸鼠移植瘤模型，考察小分子对活体肿瘤的抑制能力。

通过免疫印迹和Q-RT-PCR的方法，初步筛选出了对p-STAT3和Hif1α具有双靶点抑制活性的小分子。并进一步通过SPR、GST-pull down、MG132阻断实验等方法，证明了小分子的作用机理：即在STAT3磷酸化中，阻断了STAT3蛋白与EGFR蛋白的结合过程，降低了STAT3磷酸化程度，减少p-STAT3的形成；在Hif1α降解过程中，阻断了Hif1α与P300的相互作用，加速Hif1α的水解，减少了Hif1α的表达。并通过模拟计算的方法，推测了药物在STAT3和Hif1α蛋白上的具体结合位点。

根据上述研究成果，本发明认为二萘嵌苯类小分子可以选择性的抑制pSTAT3、Hif1α及其下游的VEGF、Bcl2、GluT1等蛋白的表达，从而阻断pSTAT3信号通路、Hif1α信号通路这两条在癌症发生发展中起关键作用的信号通路。此外，通过MTT方法，验证了小分子的低毒性，以及对癌细胞的促凋亡能力。通过裸鼠移植瘤模型，证明了药物在哺乳动物体内具有较高的抑制p-STAT3/Hif1α信号传导通路、治疗相关疾病的活性。

本发明提供的p-STAT3/Hif1α信号传导通路抑制剂具有以下优点：高效率、低毒性、多靶点同时作用、适用范围广的优越性能。

附图说明

图1为药物分子对pSTAT3、Hif1α及相关蛋白表达水平的影响。

图2为药物分子对pSTAT3、Hif1α及相关基因转录水平的影响，以及对癌细胞的毒性。

图3为药物分子抑制pSTAT3信号传导通路的原理。

图4为药物分子抑制Hif1α信号传导通路的原理。

图5为通过裸鼠动物模型，验证药物分子对活体动物的药效。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

本发明中所用的3，4，9，10-二萘嵌苯四甲酸二酐、伯胺(除注明合成以外)等反应试剂，均在百灵威公司购买，溶剂购买自国药集团。

所用伯胺类化合物3-(1’-哌啶基)-1-丙胺的合成方法如下：

将18g N-乙酰基-3-溴代丙胺与150mL三乙胺混合，加热至回流，向其中滴加12mL无水哌啶，反应4小时。蒸馏所得混合物，得到3-(1’-哌啶基)-1-乙酰丙胺。

将上步所得产物混合在200mL的10％硫酸中，加热回流，脱去乙酰基。所得混合物使用氯仿萃取，旋蒸除去低沸点溶剂，得到无色透明液体3-(1’-哌啶基)-1-丙胺。HPLC为96％，收率33％。

其它伯胺可用类似方法合成而得。

实施例1、式I所示化合物的合成(式1所示化合物)：

反应式：

在配有磁力搅拌器，冷凝回流装置及氮气保护装置的500ml三口烧瓶中，将3.9g(0.01mol)3，4，9，10-二萘嵌苯四甲酸二酐溶解于200mL正丁醇，加热回流，向其中滴加1.5g(0.025mol)乙二胺。回流反应4小时。停止加热，冷却到室温。若溶剂体积小于80mL，则原料难以溶解；当容积体积低于200mL，或者乙二胺投料比小于2.5时，副产物比例偏高；当溶剂体积超过250mL时，反应速率变慢，反应时间延长。

将反应液倾入500mL砂芯漏斗中，减压抽滤，以氯仿冲去残余原料，再以甲醇冲洗，收集固体，烘干，得红褐色固体粉末4.2g。

产物MS(m/e)：641；NMR：2.78(triple)；3.43(triple)；5.50(multi)；7.83(double)；8.01(double)。

由上可知，该化合物结构正确，为式1所示化合物。

实施例2、式I所示化合物的合成(式2所示化合物)：

按照与实施例1完全相同的方法，仅将原料乙二胺换为3-(1’-哌啶基)-1-丙胺。所得产物在N₂保护下充分干燥，得鲜红色产物。

产物MS(m/e)：640.5；NMR：1.53(multi)；1.59(triple)；1.72(multi)；2.45(triple)；2.48(triple)；4.13(triple)；5.45(multi)；7.83(double)；8.01(double)。

由上可知，该化合物结构正确，为式2所示化合物。

实施例3、式I所示化合物的合成(式5所示化合物)：

按照与实施例1完全相同的方法，仅将原料乙二胺换为N，N-二甲基-1，3丙二胺，得红色产物。

产物MS(m/e)：561；NMR：1.74(multi)；2.26(single)；2.46(triple)；4.12(triple)；7.83(double)；8.01(double)。

由上可知，该化合物结构正确，为式5所示化合物。

下面是本发明提供的式I所示化合物(也即p-STAT3/Hif1α抑制剂)的应用实施例：(除特殊说明外，以下实施例所述药物均为实施例3制备所得式5所示化合物完成，图1-5中所述drug亦均为实施例3制备所得式5所示化合物。)

实验所用人类癌细胞系、牛胎血清、培养基均购买自ATCC。

所用抗体，分别购买自Sigma(P300)、Santa Cruz(VEGF、GST)、BD Biosciences(Hif1α、Hif2α)、Calbiochem(Jak1)、Thermo Scientific(ER)、Cell Signaling(pSTAT3、STAT3、pSTAT1、Bcl2，以及其它未标明抗体)

免疫印迹所用醋酸纤维转印膜、感光胶片，购买自GE。

Q-RT-PCR所用仪器为ABI 7300系统，所用SYBR Green荧光探针购买自AppliedBiosystem。

SPR所用仪器为BIAcore 3000系统。

MG132、MTT试剂购买自Sigma。

GST实验所用大肠杆菌BL21(DE3)菌株由Gregg L.Semenza教授赠送；谷胱甘肽吸附凝胶，购买自Sigma；谷胱甘肽吸附柱，购买自Thermo Scientific。

实施例4、免疫印迹实验考察药物对p-STAT3和Hif1α及相关蛋白表达的影响：

免疫印迹实验主要考察不同浓度的二萘嵌苯类药物对p-STAT3和Hif1α信号传导通路上各种蛋白的影响，同时考察对各种不同细胞系的药效差异。

具体实施方案如下：将人类癌细胞系分入6孔盘，每孔细胞数为0.7×106，在37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜。药物固体粉末溶解于蒸馏水中，作为8mM药物储液，使用含0.1％胎牛血清的完全培养基稀释为工作液，工作液浓度为1-20μM。

对于STAT3表达检测实验：在细胞完全贴壁后，将6孔盘中的培养基更换为含有0.1％胎牛血清以及20ng/mL的IL-6的完全培养基，继续孵育30分钟。之后完全移除含IL-6的培养基，向各孔中分别加入0-20μM的工作液，在37℃、5％CO2培养箱中孵育18小时。

对于Hifa表达检测实验：在细胞完全贴壁后，将6孔盘中的培养基直接更换为0-20μM工作液，在37℃、5％CO2、1％O2以及94％N2的低氧培养箱中孵育18小时。

之后按照一般细胞收割方法收集各孔中的样品，14000×g离心分离，取上清液，即为总蛋白样品。使用10％的SDS-PAGE凝胶分离各总蛋白样品：样品上样后，在90V电压下运行15分钟、之后使用110V运行两小时，缓冲溶液使用TGS(Bio-rad#161-0732)。

将已经分离过的SDS-PAGE凝胶转印到醋酸纤维素膜上(AmershamTMHybond-ECL)，转印缓冲液为Invitrogen NP0006-1，在45V电压、4℃条件下转印19小时。将转印完的醋酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂牛奶中，在室温下摇动1小时。将封闭完的醋酸纤维素膜浸泡于适当浓度的一抗工作液中，在4℃条件下摇动过夜。使用TBST洗涤醋酸纤维素膜，使用HRP偶联二抗标记，在胶片上显影。

所得胶片使用Epson 1640SU扫描仪扫描图像，使用ImageJ 4.0程序读取对应条带数据，使用CurveExpert 3.2程序处理拟合曲线，测定IC50值。

所得结果表示在附图1中。IC50值总结为表1。

表1、免疫印迹方法测定的药物活性

细胞系p-STAT3抑制活性(IC₅₀)/μMHif1α抑制活性(IC₅₀)/μMMDA-MB-2312.73.0MDA-MB-4683.84.0T47D6.26.6BT4741.513.8OVCAR36.69.5CAPAN-20.94.3PANC-16.58.0

由表1可知，二萘嵌苯类药物对多种人类癌细胞系(考察对象包括四种人类乳腺癌细胞：MDA-MB-231、MDA-MB-468、T47D、BT474；人类卵巢癌细胞OVCAR3；两种人类胰腺癌细胞PANC-1、Capan-2)均具有明显的p-STAT3表达抑制活性，其IC50值基本在7μM以下。对于Hif1α，药物在全部七种癌细胞系同样表现出明显的抑制活性。因此，可以证明药物对pSTAT3和Hif1α信号传导通路的调节能力具有普适性，可以作为一种较为优秀的的双靶点抑制剂。

对于其它的信号传导通路关键基因，如AKT、ER、Her2、p-STAT1等，均未发现药物具有明显的抑制效果，因此，初步确定药物的调控活性是特异性针对于pSTAT3和Hif1α。

实施例5、定量实时反转录链式扩增反应(Q-RT-PCR)：

Q-RT-PCR反应可以用于定量表征目标基因的mRNA含量。首先提取经过二萘嵌苯类药物处理过的细胞中的总RNA，将其反转录为cDNA，使用特殊引物对待测基因进行PCR扩增。SYBR Green荧光探针可以结合到扩增产生的双链DNA上，并显色。PCR反应初始时，扩增所得的双链DNA浓度很低，无法观察到荧光信号。随着PCR反应周期进行，双链浓度呈指数上升，荧光强度也会呈指数增强，通常目标cDNA初始浓度越高，出现荧光强度指数上升的时间越早。当反应进行到一定程度，引物逐渐消耗殆尽时，荧光强度将趋于稳定。通过测定荧光强度指数上升阶段目标cDNA与参比cDNA达到同样荧光强度时的时间差，就可以推算目标cDNA的初始相对浓度，这一浓度就是细胞中对应目标mRNA的浓度，即基因转录水平。

当使用不同浓度的药物处理细胞后，转录过程受到药物影响的基因的mRNA水平会发生下降。表现为荧光指数上升阶段会相对滞后发生，由此可以定量推算出细胞中目标基因转录水平下降的程度。

Hif1α的表达激活途径比较复杂，很难通过几个上游基因的表达水平判定其转录活性状态，因此需要直接测定其mRNA含量，观察其转录过程是否受到小分子的影响。

此外，部分可以促使细胞发生癌变的蛋白，如VEGF，属于分泌型蛋白，合成后会被立即释放到细胞外。一般的免疫印迹方法只能测定细胞内蛋白水平，不能测定分泌型蛋白的表达水平。这时，通过Q-RT-PCR方法，就可以推测这些分泌型蛋白是否受到小分子的影响。

具体实施方案如下：按照实施例七中的方法准备6孔盘并使用药物处理细胞。使用Tri-reagent(invitrogen)收割细胞，使用氯仿提取总RNA，使用异丙醇沉降总RNA，使用NanoDrop 1000(Thermo Scientific)测定总RNA浓度。

将1μg的总RNA，1μL的0.5μg/μL随机引物(Promega)，2.5μL的10mM dNTP混合物(invitrogen)，10μL的5×反转录缓冲溶液(invitrogen)，5μL的0.1M DTT(invitrogen)以及1μL的Rnase抑制剂(invitrogen)均匀混合，使用DEPC水定容至49μL。将混合物加热至65℃保持3分钟，然后在室温下放置5分钟，再向其中添加1μL的SuperScriptII反转录酶(invitrogen 100004925)，混合均匀，42℃孵育1小时。

将所得的cDNA用DEPC水1∶5稀释，作为模版。将10μL模版样品与12.5μL的荧光探针SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystem)以及各0.75μL的正向/反向引物(序列参见表2)在96-孔光学反应盘中均匀混合，使用DEPC水补充至每孔25μL。所有模版样品均按同样方式处理，以β-actin作为参比。从每种模版样品中各另取2μL均匀混合，使用DEPC水连续稀释成1倍、10倍、100倍、1000倍混合样品，以这一组混合样品作为相对浓度标准曲线。PCR反应使用ABI 7300实时PCR系统完成，进行40个循环扩增。所有数据使用Microsoft Excel处理，相对浓度曲线由连续稀释的混合样品组数据整理获得，目标样品的数据减去对应参比样品数据，所得的值在标准曲线上读出对应相对浓度。

表2、用于Q-RT-PCR的引物列表

实验数据参见附图2-A、附图3-B。

当药物浓度由0上升至20μM时，Hif1α的转录水平并没有发生明显变化，而此时其表达水平已经几乎下降到10％。由此可以判断，药物对Hif1α的抑制并不是发生在转录水平上。

GluT1是Hif1α的重要下游基因，该基因发生转录活化，可以提高细胞对养料的摄取效率，是细胞面对组织缺氧状态的一种有效抵抗。可以看出，细胞在未经低氧处理时，GluT1的转录水平极低，经过低氧处理，GluT1转录活性大幅提高；随着使用药物处理细胞，低氧状态下原本高转录的GluT1的转录水平逐渐下降。这一结果一方面说明药物可以抑制癌细胞过多摄取营养的行为；另一方面也表明，药物的作用位点是发生在GluT1转录之前，即其上游的Hif1α上。

VEGF是促进血管新生的重要基因，它同时受p-STAT3和Hif1α双方的调控。通过p-STAT3信号传导通路活化VEGF，可以为癌症发生提供充足养料并提高癌症迁移几率；通过Hif1α信号传导途径活化VEGF，可以减缓组织缺氧现象。因此VEGF是一个直接关系到癌症发展的重要基因。与GluT1的情况相似，通过施加药物可以降低VEGF的转录活性，这一结果表明药物直接作用于VEGF的上游，即p-STAT3和Hif1α上。与GluT1不同的是，VEGF还可能受到多种其它信号传导途径(如AKT)的影响，因此其随药物浓度上升转录水平下降得较慢。

通过Q-RT-PCR实验，可以再次确定药物的作用位点是在p-STAT3和Hif1α上，同时也充分验证其对这两条信号传导途径的阻抑效果会向下游延伸，并最终实现抗癌活性。

实施例6、MTT药物毒性实验：

只有活细胞才可以摄入MTT。在细胞的氧化呼吸活动中，MTT会被氧化成为紫色物质。因此，在细胞培养基中加入MTT一段时间以后，将细胞裂解，测定裂解液在540nm处的吸光度，即可定量判断细胞的氧化代谢能力。经过一定剂量的二萘嵌苯类药物处理，如果癌细胞的氧化代谢能力大幅下降，则说明药物具有诱导细胞凋亡的能力。

具体实施方案如下：使用200μL的PBS缓冲液填充96孔盘的外周孔。使用Trypsin-EDTA处理贴壁细胞，并将所得细胞悬液均匀分入96孔盘，每孔细胞数为20,000。将96孔盘放置于37℃、5％ CO2的培养箱中孵育过夜。移去原培养基，每孔加入100μL的含有2％牛胎血清的完全培养基，继续孵育1小时。对于一种人类癌症细胞系检测，准备3块同样的含有细胞的96孔盘，以及1块不含细胞的参比盘。

药物固体粉末溶解于蒸馏水中，作为8mM药物储液，使用含2％胎牛血清的完全培养基稀释为工作液，工作液浓度为1-20μM。全部移去96孔盘中的原培养基，每孔加入100μL工作溶液，5个孔一组使用同一浓度的工作溶液。按照同样的排列顺序处理全部96孔盘，将3块含有细胞的96孔盘置于37℃、5％ CO2的培养箱中分别孵育12小时、24小时、48小时。之后，立即移除工作液，向每孔中加入100μL的MTT检测液(新配的含有1mg/mL的MTT的2％牛胎血清完全培养基)。将处理过的96孔盘避光放置于37℃、5％ CO2的培养箱中孵育2小时，之后立即向每孔中加入100μL细胞裂解液(20g的SDS溶解于50mL蒸馏水以及50mL的DMF混合溶液中所得)，避光室温放置过夜。使用Thermo MultiSkan EX系统读取540nm以及690nm下各孔吸光度数据。全部样品数据减去对应的参比盘数据，所得的540nm组数据减去对应的690nm组数据，5个相同浓度孔数据取平均值，以对应药物浓度作图，得到细胞活性-浓度曲线。

其结果如附图2-B所示：在1-10μM剂量内，药物对正常人类表皮细胞MCF10a的生长没有明显影响，但却足以将两种乳腺癌细胞系的生存率降至25％以下。

通过MTT实验，可以看出药物分子对于依赖于p-STAT3、Hif1α信号传导途径的癌细胞系，具有很明显的促凋亡作用，而且细胞对这两条信号传导途径的依赖性越高，药效越强。另一方面，药物分子的毒性较低，普通细胞如MCF10a可以容忍一般剂量，其生长状态未受到明显影响。因此，可以判断该药物可能成为一种有效的抗癌药物。

实施例7、考察药物阻断p-STAT3信号通路机理的实验：

免疫印迹方法分析时间药效：

在免疫印迹方法分析药物药效时，可以观察到在药物高浓度时，部分p-STAT3上游磷酸化蛋白也会有表达下降的情况。为了进一步明确药物直接作用于STAT3磷酸化过程，而非直接抑制上游磷酸化蛋白表达这一结论，使用免疫印迹方法，观察在使用二萘嵌苯类药物处理后，MD-MBA-231细胞中各相关蛋白随时间变化的趋势。

具体方法同实施例七。结果参考附图3-C：

实验中所用药物浓度均为10μM，时间观察范围为加药后6小时内。可以看到在施加药物0.5小时后，p-STAT3就明显下降，而其上游上游各主要磷酸化蛋白(JAK1、JAK2、Src)均无明显变化；至施药6小时后，p-STAT3已经基本消失，此时上游各主要磷酸化蛋白仍有很高的表达量。

可见，药物并不影响STAT3磷酸化过程的上游调控蛋白，也不影响STAT3的表达水平。在高浓度药物作用下部分上游调控蛋白表达下降，可能是因为存在p-STAT3对上游调控蛋白的反馈通路所致，即p-STAT3表达下降可能通过其它信号传导通路反过来引起上游蛋白表达下降。由此，进一步确信药物直接影响的是STAT3磷酸化的过程，即抑制了STAT3蛋白与其上游磷酸化蛋白的相互作用。

通过SPR实验验证药物作用位置：

在p-STAT3信号通路中，表皮生长因子受体(EGFR)起到了为STAT3磷酸化提供反应场所的作用。磷酸化的EGFR在细胞内可以招募去磷酸化的STAT3以及JAK类激酶，并通过后者使STAT3发生磷酸化。目前的研究表明，EGFR上酪氨酸残基1068(Y1068)附近的氨基酸序列对STAT3与EGFR的结合具有重要影响，Y 1068发生磷酸化后，其附近序列暴露出来，这一序列能够与STAT3的SH2结构域相结合，使STAT3靠近结合在EGFR上的JAK类激酶(Chemical Probes that Competitively and SelectivelyInhibit Stat3 Activation.Xuejun Xu，Moses M.Kasembeli，Xueqing Jiang，Benjamin J.Tweardy，David J.Tweardy，PloS ONE，2009，Vol.4，e4783.)。

为了研究药物对STAT3磷酸化过程的影响，我们合成了Y1068附近的12个氨基酸残基序列，并将其与生物素偶联，固化在SPR检测芯片上，作为固定相。这些序列分为两组：一组含有磷酸化的Y1068；一组含有去磷酸化的Y1068。之后，我们使含有纯化的STAT3蛋白的流动相流经固定相，对于含有磷酸化Y1068的固定相，可以大量特异性结合STAT3蛋白；去磷酸化的固定相，则只有少量非特异性吸附发生。结合了蛋白(STAT3)的固定相，由于表面分子的分子量变大，其共振信号发生改变，从而被SPR仪检测到，固定相表面12肽与蛋白的结合率越高，SPR检测到的信号越强。去磷酸化的固定相，则作为参比，两种固定相之间的信号差值，即为STAT3特异性吸附的强度。

当在流动相中添加了药物后，二萘嵌苯类药物分子若能阻碍STAT3与固定相的结合，则可观察到SPR信号下降。掺入的小分子浓度越高，则信号下降的幅度应该越大。

药物固体粉末溶解于蒸馏水中，作为8mM药物储液，使用SPR缓冲液(组成为20mM Tris-HCl、2mM的mercaptoethanol以及5％的DMSO，pH为8.0)稀释至0-400μM药物工作溶液。将190μL的200nM的Stat3蛋白溶液与10μL的0-400μM药物工作溶液均匀混合，最终形成一组体积均为200μL的0-20μM药物待测样品。

药物分子与STAT3蛋白相互作用实验通过BIAcore 3000型SPR系统完成。使用SPR缓冲液作为流动相，流速设定为10μL/min，温度设定为25℃。实验所用固定相检测芯片上，分别固化了生物素偶联的磷酸化/去磷酸化的EGFR蛋白序列(LPVPE(pY)INQSVP)，磷酸化位点为Y1068。30μL参比样品(含有Stat3蛋白，但不含有药物分子)最先被注射入系统检测。之后所有样品按浓度从低到高顺序依次注入检测，注入量均为30μL，每个样品检测完毕后，注入10μL浓度为100mM、pH为1.5的甘氨酸溶液，使固定相检测芯片再生。在全部样品检测完毕后，再次注入30μL参比样品。全部数据由BIAevaluation Software version 4.1软件分析，将全部磷酸化固定相SPR信号数据减去对应的去磷酸化固定相数据，将前后两个参比样品的平均值设为100％，对其余样品进行归一化，所得即为SPR曲线。

所得结果参考附图3-D。

图中曲线由上到下分别是药物浓度由0-10μM时，所得到的SPR信号随时间变化关系。在样品注入后，SPR信号开始上升，表明固定相逐渐与流动相中的蛋白相结合，曲线在150s后逐渐水平，说明结合反应达到平衡。由图可见，当药物浓度由0-10uM之间增加时，结合反应平衡时的SPR信号逐渐减弱，说明流动相中的STAT3蛋白与EGFR固定相的相互作用逐渐减弱，当药物浓度达到10μM时，已经有超过半数的STAT3不能结合到固定相上。如这种情况在细胞内发生，受到药物影响的STAT3将不能结合到EGFR上，因此无法被JAK类激酶磷酸化，这样p-STAT3的表达水平自然会下降。根据SPR实验结果，可以确信药物正是通过干扰STAT3与EGFR类蛋白间的相互作用，从而抑制了STAT3的磷酸化过程。药物分子与STAT3蛋白相互作用的示意图参考附图3-E。

实施例8、考察药物阻断Hif1α信号通路机理的实验：

MG-132阻抑实验：

根据Q-RT-PCR实验，既然Hifa表达水平下降的原因不是其转录受到抑制，那么Hif1α蛋白合成的数量应该并未发生较大改变。按照目前的认识，Hif1α在通常条件下表达量极低，是因为合成出来的Hifa很快就被蛋白酶水解，因此无法发挥其生物学活性。因此，需要考虑药物是否会通过提高Hif1α的水解效率，降低其表达水平。

MG132是一种低毒性、快速、可逆的蛋白酶抑制剂。在培养基中掺入MG132，可以阻止细胞合成出来的Hif1α被迅速分解。若二萘嵌苯类药物分子的药效会被MG132所抑制，则说明药物正是通过提高Hif1α水解效率，从而降低Hif1α表达水平的。

具体实施方案如下：使用Trypsin-EDTA处理贴壁细胞，将所得的细胞悬浊液均匀分入6孔盘，每孔细胞量为8×106，将6孔盘置于37℃、5％ CO2的培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁。药物固体粉末溶解于蒸馏水中，作为8mM药物储液，使用含有5％牛胎血清、1μg/mL的MG132的完全培养基稀释药物，形成1-20μM的工作溶液。完全移除6孔盘中的原培养基，依次移入0到20μM的工作溶液。将6孔盘放置于低氧培养箱(37℃、5％ CO2、1％ O2、94％ N2)中18小时。之后按照实施例七中所述方法收割细胞、提取总蛋白、进行免疫印迹分析。

实验结果参考附图4-B。

图中-、+分别代表MG132不存在、存在时的情况。所使用的MG132量均为1μg/mL。N代表未经低氧培养箱处理的样品，药物施加浓度分别为0、4、7μM。由图可见，在没有MG132的情况下，施加药物后，Hif1α蛋白水平明显下降；在施加MG132处理之后，再加入药物分子，Hif1α的水平并无明显变化，说明当蛋白酶受到抑制，Hif1α不会发生水解的情况下，该类二萘嵌苯药物并不能明显降低Hif1α的表达水平，由此可以推断，该药物正是通过提高Hif1α的降解速度，从而使Hif1α的表达水平降低的。

谷胱甘肽转移酶滞留(GST-pull down)实验：

在初步判明二萘嵌苯类药物通过提高Hif1α降解活性，使其表达水平下降之后，接下来就需要具体判断其作用位点是在Hif1α降解的哪一个过程中。如前所述，低氧状态下，P300(CBP)可以保护Hif1α使其避免被蛋白酶水解。因此，我们设计使用偶联有谷胱甘肽转移酶(GST)的Hif1α，即GST-Hif1α，与含有P300的细胞总蛋白提取液相作用，再使用谷胱甘肽亲和凝胶吸附收集GST-Hif1α，这样与Hif1α相互结合的P300也会被吸附到凝胶之上。当向体系中加入二萘嵌苯类药物后，如果药物能够减弱Hif1α与P300的相互作用，则吸附到凝胶上的P300量将减少，通过免疫印迹方法分析凝胶上的P300含量，即可判断药物是否有效。

将pGEX载体转染过的，具有GST或GST-HIF-1α(531-826)表达活性的大肠杆菌菌株BL21(DE3)置于100mL的LB Broth培养基中，37℃，300rpm摇动，至600nm浊度为0.35-0.45时。向培养基中加入IPTG(isopropyl-β-thio galactopyranoside)，使最终浓度为0.1mmol/L，继续摇动4小时。使用BugBuster Master Mix细胞裂解液(Novagen，Madison，WI)按照一般方法裂解细胞，提取总蛋白。将所得总蛋白通过谷胱甘肽吸附柱，提纯GST或GST-HIF-1α偶联蛋白，使用10mmol/L的还原型谷胱甘肽溶液(含有50mmol/L的Tris-HCl、pH为8.6)洗脱，得到纯化的GST或GST-HIF-1α偶联蛋白溶液，测定浓度。人类胰腺癌细胞系PANC-1按照实施例七中一般方法收割，提取总蛋白。通过高速离心方法浓缩含有P300的总蛋白溶液，使最终总蛋白浓度达到大15μg/μL。

将5μg药物分子溶解于10μL的PBST(组成为Dulbecco′s phosphate-buffered saline、0.1％的Tween-20，pH为7.4)中。将药物样品与50μg的GST或GST-HIF-1α偶联蛋白均匀混合，定容为25μL。将混合物在4℃条件下摇动3小时。之后向混合物中加入50μL的总蛋白浓缩液，均匀混合，在4℃下摇动过夜。将混合物与70μl的谷胱甘肽吸附凝胶均匀混合，在4℃下继续摇动4小时。在4℃下将混合物以8200×g离心分离1分钟，使凝胶沉降，去除上清液，以PBST洗涤三次。向离心所得凝胶中加入70μL的2×SDS上样缓冲液(Bio-Rad)，95℃加热5分钟，10000×g离心1分钟，取40μL上清液上样，通过8％的SDS-PAGE电泳分离，按照一般的免疫印迹方法转印，使用anti-P300抗体检测P300保留量，使用anti-GST-HPR抗体检测GST或GST-HIF-1α偶联蛋白水平。

实验结果如附图4-A所示：

图中G-H代表与含有P300的细胞总蛋白提取液相混合的样品中含有GST-Hif1α蛋白，GST表明使用单纯的GST取代了样品中的GST-Hif1α蛋白。可以看出，在只有GST的组中，几乎没有P300被滞留下来，这表明无论是凝胶本身还是GST都与P300没有相互作用。当样品中加入GST-Hif1α蛋白后，可以观察到明显的P300条带，这说明P300会被Hif1α滞留在凝胶上。继续加入二萘嵌苯类药物后，可以观察到P300的条带明显减弱，而GST-Hif1α的条带基本不变，这表明P300的减少是因为GST-Hif1α受到药物的影响，不能与P300特异性结合，因此不能将P300滞留下来。

由此可以证明，二萘嵌苯类药物分子在Hif1α信号通路中的作用机理正是阻断Hif1α与P300的结合，使Hif1α脱离P300的保护，更快的被蛋白酶降解，从而降低了Hif1α的表达水平。

实施例9、裸鼠模型药效试验：

在充分证明了二萘嵌苯类药物分子能够在细胞水平上特异性阻抑p-STAT3和Hif1α信号通路之后，进一步采用裸鼠动物模型，验证药物在动物上药效。即在裸鼠背部种植入人类癌细胞，使之发育成肿瘤，再通过注射药物，观察其抑制动物身上肿瘤生长的能力以及对动物的毒性。

具体实施方案如下：选取大小接近的3-4周的裸鼠，在实验室环境下饲养一周，使之适应环境。使用的人类癌细胞系为胰腺癌PANC1，按照实施例七中方法处理，获得悬浮细胞液，浓度为3.5×10⁷/mL。向裸鼠背部注入癌细胞，细胞数为7×10⁶每只。继续饲养一周，观察肿瘤发育情况。选取肿瘤发育程度接近的裸鼠，分成两组，每组5-6只。

将5mg药物分子溶解于10mL的PBS，形成药物工作液。称取裸鼠体重，按照2mg/千克体重将药物注射入一组裸鼠背部肌肉。另一组作为对照组，只注射PBS。每隔一天注射一次，每次注射前称取裸鼠体重并测量肿瘤体积。

在首次注射10天以后，停止注射，继续观察一周。之后解剖裸鼠并称量肿瘤重量。以药物注射组和对照组对比，观察药效。

实验结果见附图5。从图中可以看出，在开始注射以前，两组裸鼠背部的肿瘤大小接近。在注射后18天，对照组肿瘤明显增大，而药物注射组肿瘤明显变小。解剖结果表明，药物注射组裸鼠肿瘤组织的平均重量只有对照组的1/8，肿瘤的生长明显受到抑制。由此。可以充分证明药物在动物模型上的活性。