FoxM1在卵巢癌中的表达及转录调控机制的初步研究

摘要

研究背景:
　　卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一,由于缺乏有效的早期诊断方法,死亡率仍然位于女性生殖器恶性肿瘤之首[1],75％的患者确诊时已到晚期,五年生存率仅为30%-40%[2]。目前对卵巢癌治疗的标准方案是在肿瘤细胞减灭术的基础上施以紫杉醇与铂类药物为主的联合化疗,然而随着耐药现象的出现,常常使治疗无效,已成为严重威胁女性生命的最大疾患。因此,卵巢癌的预防和治疗已成为妇科肿瘤研究的最重要课题之一。
　　FoxM1为Forkhead转录因子家族重要的成员之一,是与癌症发生、发展密切相关重要的转录因子。它由10个外显子构成,且定位在约20kb的染色体端粒位置12p13-3。FoxM1具有三种剪接异构体,即FoxM1A,B和C,其中FoxM1B和C在癌组织中高表达,在正常细胞和组织中低表达[3-5],发挥转录激活、促癌发生和发展的作用,而FoxM1A在癌组织中低表达,发挥转录抑制功能。作为一个转录因子,其主要功能为通过转录激活细胞周期调控蛋白,加快肿瘤细胞周期进程;转录激活VEGF,促进肿瘤血管的生成;转录激活MMP2、MMP9,促进肿瘤的侵袭与转移。另外,大量的生物芯片研究表明FoxM1与卵巢癌密切相关[6]。因此,FoxM1是一个重要的肿瘤标志物,对于卵巢癌诊断及治疗都具有重要意义。
　　在真核生物基因表达调控中,转录水平的调控是最重要的环节,它是通过特定的转录因子与靶基因的调控序列及其启动子的特异性结合才能有效的调控基因的转录。但是到目前还没有关于转录因子与FoxM1基因核心启动子区特异性结合并能够有效地调控其转录活性的相关报道。因此,通过对FoxM1基因启动子的克隆,研究其表达调控的机制,为阐明FoxM1基因的生物学功能及与卵巢癌发生、发展的关系提供了理论基础。
　　目前普遍认为,基因组DNA异常甲基化与肿瘤的发生密切相关,CpG岛的局部甲基化是恶性肿瘤中存在的普遍现象,它往往早于明显的恶性表型出现。大量的研究证明了DNA甲基化可影响转录因子结合到含有CpG岛的识别序列,从而调控基因的表达。因此,研究FoxM1启动子区CpG岛甲基化状态与卵巢癌的相关性,以及探讨DNA甲基化对FoxM1转录调控的影响,对于理解卵巢癌的发生、发展的分子机制具有重要的意义,为卵巢癌的早期诊断及靶向治疗提供新的思路。
　　目的:
　　1.明确FoxM1在卵巢癌细胞及卵巢癌组织中的表达;
　　2.明确FoxM1核心启动子区域;
　　3.初步探讨转录因子Sp1对FoxM1基因的转录调控作用;
　　4.确定在卵巢癌中,DNA甲基化修饰与FoxM1表达调控的关系,评价FoxM1在卵巢癌的早期诊断和治疗中应用的可行性。
　　内容及方法:
　　1.检测FoxM1在卵巢癌细胞系及卵巢癌组组织中的表达
　　1)我们用实时荧光定量PCR和Western blot技术分别检测了FoxM1在卵巢癌细胞系(HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70)中的表达水平。
　　2)同时我们运用实时荧光定量PCR和免疫组化技术分别检测了35例上皮性卵巢癌组织、40例正常卵巢组织的表达情况。
　　2.确定FoxM1核心启动子区域
　　我们以正常人外周血基因组DNA为模板,用PCR技术分别扩增构建了6个长度不同但相互重叠的FoxM1基因启动子报告基因系列截短载体,通过瞬时转染293T细胞,运用双荧光素酶报告基因系统确定FoxM1基因核心启动子区域。
　　3.明确转录因子Sp1对FoxM1基因的转录调控作用
　　我们用 Sp1基因真核表达质粒和报告基因质粒共同分别转染卵巢癌细胞(顺铂敏感细胞系A2780和顺铂耐药细胞系CP70),对照组转染pcDNA3.0空载体,运用双荧光素酶报告基因系统检测Sp1对FoxM1基因转录激活作用。
　　4.DNA甲基化修饰与FoxM1基因表达调控的关系
　　我们运用CpG岛搜索软件CpGPLOT分析了FoxM1的启动子序列,然后,我们用亚硫酸盐克隆测序法检测了卵巢癌高转移细胞系HO-8910PM,低转移细胞系HO-8910,顺铂敏感细胞系A2780和顺铂耐药细胞系CP70的中FoxM1核心启动子区甲基化状况;同时我们又运用焦磷酸测序技术分别对15例上皮性卵巢癌组织、14例正常卵巢组织中FoxM1核心启动子区甲基化情况进行了检测。
　　结果:
　　1.实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FoxM1在卵巢癌细胞系(HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70)中均高表达;同时实时荧光定量PCR和免疫组化结果显示FoxM1在卵巢癌组织中的表达水平(30/35=86%)显著高于正常卵巢组织(6/40=15%,P<0.01),有统计学意义,而且这种高表达在转录水平和翻译水平上是一致的。
　　2.双荧光素酶报告基因检测结果显示,FoxM1核心启动子区位于其转录起始点上游+1～-95 bp这段序列中。
　　3.荧光素酶报告基因系统实验结果显示,Sp1结合到FoxM1核心启动子区并对其有转录激活作用。
　　4.亚硫酸盐克隆测序法检测结果显示,卵巢癌高转移细胞系HO-8910PM,低转移细胞系HO-8910,顺铂敏感细胞系A2780和顺铂耐药细胞系CP70四株细胞系中FoxM1核心启动子区的甲基化程度均很低。另外,用焦磷酸测序技术检测结果显示,15例上皮性卵巢癌组织、14例正常卵巢组织中FoxM1核心启动子区均存在着一定程度的低甲基化,且二者之间没有明显的差异(P>0.05),没有统计学意义,与其在卵巢癌细胞系中的甲基化程度基本一致。这些结果说明,在卵巢癌中DNA甲基化修饰可能不参与FoxM1的表达调控。
　　结论:
　　1.FoxM1在正常卵巢组织中低表达或者不表达,而在四株卵巢癌细胞系和上皮性卵巢癌组织中的均高表达,并且这种高表达在转录水平和翻译水平上是基因一致的,提示FoxM1基因与卵巢癌的发生密切相关。
　　2.首次确定了FoxM1核心启动子区位于其转录起始点上游+1bp~-95 bp这段序列中,为进一步研究FoxM1与肿瘤关系的分子机制奠定了基础。
　　3.确定了Sp1上调FoxM1基因的转录表达,使我们能够期望解释为什么FoxM基因在卵巢癌中高表达以及在侵袭、转移中的作用机制。
　　4.确定了卵巢癌细胞、卵巢癌组织和正常卵巢组织中FoxM1核心启动子区均存在着一定程度的低甲基化,但三者甲基化程度基本一致,没有统计学意义,提示在卵巢癌中DNA甲基化修饰可能不参与FoxM1的表达调控。

目录

封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 FoxM1基因的研究进展

2 Sp1介导的转录调控作用

3 甲基化的研究现状

实验一 FoxM1基因在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 FoxM1基因核心启动子区域的初步鉴定与分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 转录因子Sp1对FoxM1基因的转录调控作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 在卵巢癌中DNA甲基化修饰与FoxM1表达调控的关系

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

研究成果