听神经病谱系障碍基因突变筛查及NELL2基因在出生后小鼠耳蜗的表达研究

摘要

第一部分常染色体显性遗传性听神经病谱系障碍家系鉴定及基因筛查
　　目的:针对本课题组收集到的一个听神经病谱系障碍(ANSD)家系进行临床听力学检查及相应系统检查,明确发病特点及分析遗传学特点,并对该家系进行聋病基因筛查以期明确致病基因。
　　方法:该家系4代共24人作为研究对象,进行ABR、EOAE、言语分辨率、电子耳镜、声导抗测听、颞骨薄层CT及内听道MRI等检查,并详细查体及询问病史排除系统性疾病。在确定遗传特点的基础上,对已知聋病基因进行筛查,采集受试者外周静脉血提取基因组 DNA,应用在线引物设计软件 Primers进行引物设计,采用直接测序法对已知ANSD相关基因进行测序,使用DNAMan软件对序列进行比对分析。在前述实验基础上,进行全基因组外显子测序,首先采集两名患者及一名正常家系成员行全外显子测序,对初筛基因与 NCBI基因库数据进行表型及功能鉴定排除与ANSD无关联的基因突变,初步确定可能致病基因,再将家系所有患者样本与前述初筛样本进行连锁分析,最终确定候选基因。
　　结果:该家系24人中有4人符合非综合征型ANSD诊断,连续三代发病,男女发病比例均等,符合常染色体显性遗传疾病特点。对家系中全部患者及部分听力正常成员完成 ANSD相关的常染色体显性遗传基因 DIAPH3、常染色体隐性遗传基因OTOF、PJVK及非综合征型耳聋致病基因GJB2、GJB3基因外显子及线粒体DNA12S rRNA1494、1555位点的测序分析,均未发现可疑致病突变。经全基因组外显子测序,该家系中初筛样本中检出碱基突变260个,经与家系中健康成员比对,筛出可能致病突变47个,在进行表型、功能鉴定后及与家系其他成员连锁分析后发现,全部患者存在NELL2基因的错义突变(c457F),而听力正常成员及散发ANSD患者未见该突变存在。
　　讨论:该家系发病符合常染色体显性遗传性非综合征型听神经病谱系障碍,但是基因筛查未能检测到目前已知聋病基因在该家系患病成员中发生突变,提示可能存在未知的致病基因。而全基因组外显子测序则提示本家系全部患者存在NELL2基因的突变,经与哈佛大学基因文库检索发现该基因在耳蜗内有表达,高度提示可能是新的ANSD致病基因,具体功能有待于进一步研究。
　　第二部分 NELL2基因在出生后小鼠耳蜗内的表达研究
　　目的:基于ANSD家系聋病基因筛查结果,研究NELL2基因在出生后小鼠耳蜗内表达分布规律。
　　方法:以C57小鼠为实验动物,选择出生后0天、3天、7天、14天、28天为时间节点,采用免疫荧光染色、Western Blot及RT-PCR技术,从蛋白和mRNA水平观察小鼠出生后不同发育阶段NELL2基因在耳蜗的表达与分布规律。
　　结果:NELL2在小鼠耳蜗有表达,并呈现随着日龄递增表达逐渐增强的趋势。表达部位是耳蜗内毛细胞、外毛细胞、螺旋神经元及内柱细胞、外柱细胞胞浆内。P0、P3期Corti器形态不成熟,此时该区域NELL2表达不明显,从P7开始至P28随着Corti器的成熟,免疫荧光显示NELL2表达呈现逐渐增强的趋势,在螺旋神经元的表达则从P0开始呈现持续逐渐增强的趋势。Western Blot检测结果显示蛋白表达趋势与免疫荧光染色一致,数据分析有统计学意义。但是RT-PCR结果显示无论是在毛细胞还是螺旋神经元,NELL2 mRNA表达峰值均出现在P7,P14、P28则较之呈下降趋势。
　　讨论:我们的实验证实NELL2在出生后小鼠耳蜗有表达,并且随着小鼠日龄的增加NELL2蛋白的表达有逐渐增强的趋势,并与Corti器形态的成熟和听功能的形成在时间点上相一致,提示NELL2蛋白可能在Corti器的成熟及听觉神经细胞的功能维持上发挥作用。但是和蛋白在P0至P28期间表达持续性增高不同,RT-PCR检测显示 NELL2 mRNA表达的峰值出现在 P7,此后则出现明显的下降趋势。提示NELL2的表达可能受到了某种或多种机制的调控,需要继续深入研究。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 听神经病谱系障碍研究现状

2 NELL2基因研究现状

第一部分 常染色体显性遗传性听神经病谱系障碍家系鉴定及基因筛查

实验一 听神经病谱系障碍家系临床鉴定

1 研究对象

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

实验二 听神经病谱系障碍家系聋病基因筛查

1 研究对象

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

实验三 听神经病谱系障碍家系全基因组外显子测序

1 研究对象

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 NELL 2基因在出生后小鼠耳蜗的表达研究

实验一 出生后小鼠耳蜗NELL 2免疫荧光染色

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 出生后小鼠耳蜗NELL2 Western Blot和RT-PCR检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢