IL-21对慢性HBV感染者CD8+T细胞功能影响的体外研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染广泛流行于世界各国,已成为严重威胁人类健康的世界性疾病,也是我国危害性最严重、当前流行最为的一种疾病。根据卫生部发布的数据,我国当前仍然有慢性乙肝患者3000万,并且每年大约有30万人死于重症肝炎、肝硬化和肝细胞癌等与乙肝病毒感染相关的肝病。然而至今未阐明HBV感染慢性化的机制。有研究发现,主要由CD4+T细胞分泌的IL-21可以促进CD8+T细胞的增殖分化,在一定程度上增强CD8+T细胞应答,在病毒感染慢性化的控制中起到至关重要的作用。
　　目的:
　　通过体外实验,观察IL-21对不同临床表现HBV感染者特异性T细胞中IFN-γ、PD-1及IL-21的表达水平的的影响及其相互关系,为阐明IL-21在HBV慢性感染者T细胞功能衰竭中的作用提供实验依据。
　　方法:
　　1.收集38例HBV感染者(其中CHB患者19例,AHB患者19例)及10例正常对照者的外周血,并完善患者HBsAg定量、HBeAg定量、HBeAb定量、HBV DNA定量、ALT、AST、肝脾 B超等临床资料。2.密度梯度离心法分离标本外周血中的PBMC,并冻存。3.在IL-2和抗CD28存在情况下分四种条件(阴性刺激、HBV核心蛋白抗原全肽库刺激、HBV核心蛋白抗原全肽库和IL-21共同刺激、IL-21刺激)分别培养PBMC。4.用流式细胞仪检测CD8+T细胞PD-1、IFN-γ及CD4+T细胞IL-21表达水平。5.分析HBV感染者不同刺激条件下的CD8+T细胞PD-1、IFN-γ及IL-21表达水平之间差异和相关性。
　　结果:
　　1.慢性乙型肝炎组特异性CD+3CD8+IFN-γ+T细胞表达量在HBV核心蛋白肽库刺激(2.93±1.22％)、HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激(3.36±1.01%)、阴性未刺激(4.16±1.57%)、IL-21刺激(4.80±1.91%)依次升高,其中IL-21刺激下的表达量高于HBV核心蛋白肽库刺激、HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激的表达量具有统计学意义;
　　2.慢性乙型肝炎组特异性 CD3+CD8+IFN-γ+T细胞表达量在四种刺激条件下均高于急性乙型肝炎组:阴性未刺激时特异性CD3+CD8+IFN-γ+T细胞表达慢性乙型肝炎组(4.16±1.57%)较急性乙型肝炎组(2.13±1.53%)有所升高;HBV核心蛋白肽库刺激时特异性CD3+CD8+IFN-γ+T细胞表达慢性乙型肝炎组(2.93±1.22%)较急性乙型肝炎组(1.34±0.38%)有所升高;HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激时特异性CD3+CD8+IFN-γ+T细胞表达慢性乙型肝炎组(3.36±1.01%)较急性乙型肝炎组(1.86±0.90%)有所升高;IL-21刺激时特异性CD3+CD8+IFN-γ+T细胞表达慢性乙型肝炎组(4.80±1.91%)较急性乙型肝炎组(1.54±0.53%)显著升高,p均小于0.001,有统计学意义;
　　3.慢性乙型肝炎组特异性CD3+CD8+PD-1+T细胞表达量在四种刺激条件下均高于急性乙型肝炎组:阴性未刺激时特异性 CD3+CD8+PD-1+T细胞表达慢性乙型肝炎组(5.44±3.65%)较急性乙型肝炎组(2.68±1.72%)有所升高,p<0.01;HBV核心蛋白肽库刺激时特异性 CD3+CD8+PD-1+T细胞表达慢性乙型肝炎组(5.26±3.51%)较急性乙型肝炎组(2.34±1.82%)有所升高,p<0.01;HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激时特异性 CD3+CD8+PD-1+T细胞表达慢性乙型肝炎组(5.08±3.36%)较急性乙型肝炎组(2.96±2.23%)有所升高,p<0.05;IL-21刺激时特异性CD3+CD8+PD-1+T细胞表达慢性乙型肝炎组(7.32±5.09%)较急性乙型肝炎组(4.03±2.08%)有所升高,p<0.05,结果均有统计学意义;
　　4.各因子相关性分析:在IL-21与PD-1相关性研究中发现急性乙型肝炎组中除阴性未刺激(r=0.527,p=0.019)、IL-21刺激(r=0.313,p=0.207)外,IL-21与PD-1的表达水平在HBV核心蛋白肽库刺激(r=0.774,p=0.0001)、HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激(r=0.737,p=0.0003)呈现了很好相关性;在慢性乙型肝炎组中除IL-21刺激(r=0.533,p=0.027)外,IL-21与PD-1的表达水平在阴性未刺激(r=0.753,p=0.0003)、HBV核心蛋白肽库刺激(r=0.930,p<0.0001)、HBV核心蛋白肽库刺激和IL-21共同刺激(r=0.82,p<0.0001)呈现了很好相关性;
　　5.研究发现HBV DNA、HBsAg定量、HBeAg定量、ALT、AST与慢性乙型肝炎组及急性乙型肝炎组中的IL-21、PD-1和IFN-γ各因子之间均无相关性。
　　结论:
　　1.慢性乙型肝炎患者特异性CD8+T细胞IFN-γ和PD-1的表达均高于急性乙型肝炎患者,提示慢性乙型肝炎患者持续存在HBV特异性CD8+T细胞反应,并受到PD-1的免疫控制。
　　2.IL-21体外刺激时可增强慢性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+T细胞IFN-γ的分泌,从而增强其功能。
　　3.在HBV感染时,IL-21对CD8+T细胞的PD-1表达无直接抑制作用,当CD4+T细胞IL-21表达增高时,CD8+T细胞PD-1表达被动升高。
　　4.HBV核心蛋白T细胞表位肽库可能对T细胞的功能有抑制作用。

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前言

文献回顾

正文

1 材料

1.1主要仪器

1.2 主要溶液

1.3 主要试剂

1.4 研究对象

2 方法

2.1 外周血PBMC的分离

2.2 HBV核心肽库的合成>GenC_Core

2.3 HBV核心肽库的溶解

2.4 IL-21体外培养PBMC

2.5 流式细胞仪检测CD3+CD4+IL-21、CD3+CD8+PD-1及CD3+CD8+IFN-γ的表达

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 受试对象一般临床资料比较

3.2流式细胞检测外周血CD3+CD4+IL-21、CD3+CD8+PD-1及CD3+CD8+IFN-γ结果及分析

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢