NEDD9在肝癌中的表达及其与肝癌细胞生物学特性之间关系的研究

摘要

背景：原发性肝细胞肝癌（HCC）的发病率逐年上升，目前，在世界范围内，它已经是处于第二位的癌症致死原因，每年大约有800000的肝癌患者死亡。肝癌的根治性治疗手段包括根治性肝癌切除、肝脏移植和经皮肝癌射频消融术，除此之外的选择性肝动脉栓塞化疗（TACE）、放射性栓塞以及系统的全身化疗都是姑息性治疗手段。在临床工作中，医务工作者们往往根据患者的肿瘤特征、肿瘤分期以及患者身体状况采取个性化的治疗方案。其中只有早期肝癌患者适合采取根治性治疗手段，其5年生存率也相应较高，能够达到75％。通常来说，当有症状时发现的肝癌往往已经有了沿脉管系统的侵犯或者肿瘤体积过大，15%的肝癌患者诊断时已经有了肝外转移，最常见的转移器官包括肺脏、腹腔淋巴结、骨和肾上腺，这些患者只能采取姑息性治疗手段。但是无论是早期肝癌患者还是晚期肝癌患者，困扰临床医生的一个问题是患者在治疗过程中或治疗后不久就出现了肝内或者其它远处脏器的复发和转移。既往的研究已经表明，肝癌的复发和转移是一个包含多个关键分子、多条信号通路的多步骤生物学过程，在此过程中，肿瘤细胞会经历一个多基因的变化过程，从而导致其增殖潜能增加，凋亡耐受以及转移能力的增强。因此，探索寻找与肝癌复发转移相关的关键敏感基因，从而揭示这个过程的深层次机制，对于改善肝癌的治疗和预后有着重要意义。
　　NEDD9的英文完整名称是 Neural precursor cell Expressed Developmentally Down regulated9，在一些文献里还被描述为HEF1（Human enhancer of filamentation1），另外还有一种形式是 Cas-L，它的 mRNA包含2505nt。很多研究都已经把NEDD9基因定位于一个能够决定肿瘤转移的“开关”。在转移性乳腺癌中，有一系列的异常表达基因可以作为特征性表现，而NEDD9正是其中一员。在高侵袭的胶质瘤中，NEDD9是前致癌基因 FAK激酶的特异性效应分子，对于肿瘤细胞的迁徙和侵袭至关重要，利用转基因的手段下调NEDD9的表达水平能够削弱此种细胞的转移能力。通过饱和性比较基因杂交的方法，在转移性黑色素瘤的大基因组学研究中发现，NEDD9在一个小鼠转移性黑色素瘤动物模型中是一个扩增子的目标基因，而这个扩增子与肿瘤的转移关系密切。相似的研究证实在转移性黑色素瘤中，NEDD9无论是在mRNA还是蛋白水平其表达量均明显升高，即便是在没有基因扩增的情况下依然如此，而且这种表达量的升高与肿瘤转移过程密切相关。总得来说，NEDD9在细胞的转移、生长和致癌性转化中发挥着十分重要的作用。然而 NEDD9也可能在不同肿瘤细胞的生物学过程中发挥着不同的作用，典型的例子就是在一个发生肺转移的乳腺癌细胞系中 NEDD9的表达低于正常水平，这个研究被报道在《自然》杂志。虽然NEDD9在肿瘤侵袭转移中的作用是一个近期的研究热点，但NEDD9在肝癌侵袭转移过程中的作用及其调控的相关分子网络尚未见文献报道。
　　目的：检测 NEDD9在肝癌组织中及癌旁非肿瘤肝脏组织中的表达差异，探讨NEDD9的表达与肝细胞癌一系列临床指标及预后的关系；利用基因转染、RNA干扰等技术从体内、外观察上调和下调NEDD9的表达水平对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞学特性的作用，评价其作为肝癌基因治疗靶点的意义；探讨NEDD9介导肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的可能机制。
　　方法：通过RT-qPCR和Western blot的方法检测肝癌组织和癌旁非肿瘤组织中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达；用免疫组织化学染色的手段研究肝癌组织中NEDD9的表达水平和常见临床指标之间的关系；NEDD9对肝癌复发和生存预后的意义通过采用生存分析的研究方法予以说明；通过基因重组的方法改变肝癌细胞中NEDD9的表达水平，并通过MTT、平板克隆形成实验、划痕修复实验以及Transwell小室穿膜实验分别分析NEDD9在体外对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过小鼠动物模型研究NEDD9在体内对肝癌细胞增殖、侵袭以及转移能力的作用。末尾研究了NEDD9通过何种分子机制促进肝癌细胞增殖、迁移以及侵袭。
　　结果：
　　1、第一部分实验结果证明肝癌组织中NEDD9的mRNA及蛋白表达水平明显高于相应的癌旁非肿瘤肝脏组织，此外NEDD9的表达量与肿瘤大小、肿瘤病理分化程度、有无其它脏器转移、有无门静脉侵犯以及肿瘤的TNM分期有关。生存分析显示，NEDD9高表达的肝癌患者的术后无瘤生存时间以及总生存时间均明显短于 NEDD9低表达的肝癌患者。NEDD9的表达水平可以作为一个独立的肝癌预后指标，甚至包括一些临床上难以判断复发和预后的肝癌亚组。
　　2、第二部分体外实验发现，肝癌细胞系中NEDD9 mRNA表达水平均明显高于正常肝脏细胞系，肝癌细胞系的NEDD9蛋白表达水平显著高于正常肝脏细胞系。肝癌细胞相比较正常肝脏细胞表现出了较强的增殖、迁移及侵袭能力，这种增殖、迁移以及侵袭能力的差异与其 NEDD9 mRNA水平和蛋白水平的表达差异有着类似的趋势。通过慢病毒转染的方法稳定转染MHCC-97H以及Huh7细胞，分别上调和下调了两种肝癌细胞中NEDD9的表达后发现，经过转染上调NEDD9基因表达后的两种肝癌细胞的增殖、运动迁移以及侵袭能力都明显增强，而转染下调NEDD9基因表达后的两种肝癌细胞的增殖、运动迁移和侵袭能力明显减弱。体内实验中裸鼠皮下移植瘤成瘤实验结果显示，MHCC-97H肝癌细胞本身具有一定的成瘤能力，下调NEDD9表达后的 MHCC-97H细胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤能力则明显弱于对照组MHCC-97H细胞，肿瘤体积明显较小。裸鼠肝癌肺转移实验发现表达正常水平NEDD9的MHCC-97H肝癌细胞有一定的几率形成肝癌肺转移，下调NEDD9表达水平后的MHCC-97H肝癌细胞基本不会造成裸鼠肝癌肺转移。
　　3、第三部分实验结果证明NEDD9可能通过调控Fascin蛋白的表达及其结构的重组改变肝癌细胞骨架结构，从而促进了肝癌细胞的迁移和侵袭。上调肝癌细胞中NEDD9的表达后，转录因子 Snail、Slug的表达水平亦会随之上调，而 E-cadherin的表达水平会随之下调；下调NEDD9的表达后，转录因子Snail、Slug的表达水平亦会随之下调，而E-cadherin的表达水平会随之上调。在肝癌细胞中上调NEDD9的表达后，金属蛋白酶MMP-2以及 MMP-9的表达水平亦会随之上调；下调 NEDD9的表达后，金属蛋白酶MMP-2以及MMP-9的表达水平亦会随之下调。
　　结论：NEDD9在肝癌组织中的表达水平明显升高，NEDD9的表达水平与肿瘤大小、肿瘤病理分化程度、有无其它脏器转移、有无门静脉侵犯以及肿瘤的TNM分期有关。NEDD9可以预测肝癌的复发及生存预后。NEDD9在体外及体内影响了肝癌细胞的增殖、迁移以及侵袭等生物学特性。NEDD9可能通过调控Fascin蛋白的表达、重塑肝癌细胞骨架、诱导肝癌细胞的EMT过程以及调控MMP-2、MMP-9的表达等方式影响了肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学特性。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、NEDD9简介

二、NEDD9在肿瘤发生的起始、维持和进展方面的作用1、NEDD9与细胞恶性转化和肿瘤生长

三、NEDD9/Cas在化疗药耐药中的作用，其临床应用前景和作为治疗靶点的可能性。

四、总结

第一部分 NEDD9在人肝细胞癌组织中的表达及意义

1 材料（包括所涉及的手术切除标本、所用的试剂耗材以及设备仪器）

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 NEDD9对肝癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响

1 材料（包括实验中所涉及的细胞系、所用的试剂耗材以及设备仪器）

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 NEDD9影响肝癌细胞增殖、迁移以及侵袭的机制

1 材料（包括实验中所涉及的细胞系、所用的试剂耗材以及设备仪器）

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢