可注射细胞微球明胶复合物联合血小板裂解液在牙组织工程中的应用研究

摘要

口腔临床治疗过程中，观察视野及手术入路狭小，同时龋洞、根管等临床常规治疗部位的解剖形态复杂多变，操作时间亦受到限制。上述临床实际均限制了体外预成型类生物支架材料的应用，不利于组织工程技术在口腔临床治疗领域的普及。而可注射性支架材料因具有一定流动性，故可通过简便、微创的注射方式将搭载的细胞或生物活性物质递送至特定部位，并在体内固化成形以贴合适应不规则缺损。本课题组成员前期分别构建了两种可注射性的生物材料：纳米纤维微球载体（nanofibrous microspheres，NF-MS）及明胶支架（Gelatin）。NF-MS已被前期研究证实，相较于传统的实心微球载体（solid-interior microspheres，SI-MS），在促进软骨细胞黏附、增殖及软骨组织再生等方面具有更为理想的生物学效应；而Gelatin具有体内交联固化成形的水凝胶特征，能够在包被细胞或生物活性物质的基础上，维持一定时间内细胞等有效包被成分在特定部位的聚集。本研究拟基于上述两种可注射性支架材料，尝试构建复合运用两者的新模式；并以牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）为种子细胞，同时引入血小板裂解液（platelet lysate，PL）作为生长因子来源；综合上述要素，针对此模式应用于体内牙髓牙本质再生的可行性，进行前期基础性研究，以期为后续的相关研究及临床应用提供新的思路及实验基础。本研究主要结果及结论如下：
　　1．DPSCs复合微球载体培养模式下，相较于SI-MS，NF-MS能够显著促进DPSCs的体外黏附、增殖及矿化；而培养环境中PL的引入在协同扩大NF-MS上述优势的同时，也使得培养中后期生长于SI-MS上的DPSCs的上述活力显著高于同期NF-MS上未受PL刺激的DPSCs，表明PL在一定程度上弥补了SI-MS的原有劣势。细胞/微球复合物经过体外7天的矿化预刺激后，注射于裸鼠皮下8周，取材观察结果显示 NF-MS/PL组移植物内可观察到牙髓牙本质复合体样结构的形成，且新生组织的量及钙含量均显著优于其他组，而NF-MS组与SI-MS/PL组间各定量指标无显著性差异，SI-MS组体内组织新生能力相对弱于上述三组。上述结果表明DPSCs复合微球载体培养时，结合NF-MS与PL两者的优势，可以显著促进细胞/微球复合物体外、体内的成牙能力。
　　2．DPSCs复合Gelatin培养模式下，Gelatin对DPSCs的生长具有良好的支持效应；同期包被入Gelatin水凝胶的PL在细胞/明胶复合物5天的体外培养周期内，能够显著促进复合物内 DPSCs的增殖；而细胞/明胶复合物注射入裸鼠皮下8周后，Gelatin组及 Gelatin/PL组移植物内均未形成具有特征性结构的硬组织，仅可观察到散在的钙化组织。上述结果表明，虽然Gelatin能够基于其内包被的诸如PL等营养或活性物质在一定时间内支持、促进DPSCs的体内外活性，但其单独使用时并无显著支持DPSCs体内形成特征性硬组织、尤其是牙原性组织的材料属性，因而在后续实验中需要与前述的微球载体复合应用加以观察比较。
　　3．细胞/微球/明胶复合培养模式下，采用分阶段复合方式构建细胞/微球/明胶复合物：DPSCs与微球载体于体外先期复合培养，期间以含有PL的条件培养基对细胞/微球复合物进行预刺激，以调整细胞至理想生长状态；随后细胞/微球复合物经由Gelatin包被，形成细胞/微球/明胶复合物用于体内、外观察。结果显示：体外培养环境中，Gelatin内包被的PL在5天的培养周期内维持了NF-MS结合PL获得的细胞先期生长优势，并在此基础上进一步促进细胞/微球/明胶培养阶段 DPSCs的体外增殖活力；裸鼠体内移植8周后NF-MS/Gelatin组及NF-MS/Gelatin-PL组均形成了牙髓牙本质复合体样组织，而SI-MS/Gelatin组及SI-MS/Gelatin-PL组仅形成了骨样组织，相同微球载体组间的样本钙含量无显著性差异。上述结果表明，细胞/微球/明胶复合物形式下，PL促进DPSCs体内形成牙原性组织的效应是建立在前期对细胞/微球复合物的预刺激的基础上的，当PL以包被入Gelatin的形式被引入细胞外周环境时，其仅起到维持DPSCs增殖优势及促进体内非矿化组织形成的作用，这可能与本研究预设环境中，Gelatin并非有效的活性物质体内缓释系统有关。
　　综上所述，本研究尝试构建的可注射性细胞/微球/明胶复合物可能在牙组织工程尤其是牙体组织再生领域具有良好的应用前景。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、可注射性支架材料的研究现状

二、牙源性间充质干细胞的研究现状

三、血小板富集物的研究进展

第一部分 种子细胞的获取、血小板裂解液的制备及支架材料的预处理

实验一 人DPSCs的分离、培养及鉴定

实验二 人血小板裂解液及条件培养基的制备

实验三 微球载体及明胶支架的预处理

第二部分 血小板裂解液对复合微球载体三维培养模式下牙髓干细胞的生物学影响

实验一 DPSCs在微球载体上的黏附情况

实验二 血小板裂解液对复合微球载体三维培养模式下

实验三 血小板裂解液对复合微球载体三维培养模式下

实验四 血小板裂解液对复合微球载体三维培养模式下

第三部分 血小板裂解液对复合明胶支架三维培养模式下牙髓干细胞的生物学影响

实验一 DPSCs与明胶支架生物相容性的研究

实验二 DPSCs与明胶支架体内移植的研究

第四部分 细胞/微球/明胶复合物的构建及相关生物学指标的研究

实验一 细胞/微球/明胶复合物的体外研究

实验二 细胞/微球/明胶复合物的体内移植研究

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢