Sonic hedgehog信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制

摘要

角质形成细胞（keratinocyte，KC）是表皮的主要结构细胞，占表皮细胞的80％以上。KC增殖过度、凋亡不足可导致多种良、恶性皮肤疾病的发生。因此，关于KC增殖与凋亡的调控机制研究始终是皮肤学界关注的重点。越来越多的研究表明，一些高度保守的、调控胚胎发育的信号通路中部分基因突变或异常激活可导致KC的增殖或凋亡异常，其中，Sonic hedgehog（Shh）信号通路在近年来倍受关注。现有资料表明，Shh信号通路能够调控正常的增殖和凋亡，抑制该通路的信号转导能够抑制KC的过度增殖诱导细胞凋亡，但其分子机制尚不清楚。
　　细胞的代谢活动是在动态连贯、复杂有序的信号通路网络的整体调控下完成，因此，系统阐明Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制，最首要的任务就是先要明确Shh信号通路究竟通过哪条或哪些信号通路影响KC的增殖和凋亡。大量研究表明，Shh信号通路与胞外信号调节激酶信号通路（extracellular signal-regulated kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase，MEK/ERK）信号通路之间存在密切联系，MEK/ERK信号通路广泛存在于真核生物细胞中，是机体细胞增殖、凋亡、分化、迁移等信号调节网络的核心，是很多信号通路的下游通路。我们推测MEK/ERK信号通路在Shh信号通路调控KC的代谢过程中可能具有重要作用。此外，目前公认表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路是MEK/ERK信号通路的直接上游通路，大量研究提示Shh信号通路与EGFR信号通路在KC之间的关系也非常密切，如Shh信号通路能够刺激KC产生EGF，同时EGF又可以调节Shh信号通路转录因子Gli-1的表达等，进一步提示MEK/ERK信号通路在Shh信号通路调控KC的生物学行为过程中可能扮演重要角色，目前尚未见类似报道。
　　本课题旨在通过研究，阐释以下问题：①系统阐明Shh信号通路对正常KC增殖及凋亡的影响；②探讨Shh信号通路调控KC增殖及凋亡的分子机制，重点明确Shh信号通路与MEK/ERK信号通路的作用关系，同时观察Shh信号通路对PI3K/AKT和JAK/STAT1/3信号通路的影响；③进一步探讨Shh与EGFR信号通路在正常KC增殖和凋亡调控中的作用关系以及二者对MEK/ERK信号通路的影响。
　　方法：
　　体外培养人正常原代KC、永生化KC系HaCaT，采用RT-PCR和western blot检测KC中Shh信号通路关键分子Ptch-1、Gli-1的表达；CCK-8法测定细胞活力；流式细胞术PI标记法检测细胞周期分布，流式细胞术Annexin-V/PI双染法测定细胞凋亡率；采用real time PCR和western blot分别检测目的分子的mRNA转录水平及蛋白表达水平：依次观察特异性调控Shh信号通路对p-ERK1/2、p-AKT、p-STAT1、p-STAT3表达的影响；特异性阻断MEK/ERK信号通路对Shh通路诱导的cyclin D1和Bcl2表达的影响；联合调控Shh通路和EGFR信号通路对Shh诱导的p-ERK1/2、cyclin D1及Bcl2表达的影响。
　　结果：
　　1. Shh信号通路在正常KC中处于开放的活性状态；特异性上调Shh信号通路活性可促进正常KC增殖、抑制凋亡，下调Shh信号通路活性则抑制细胞增殖、诱导凋亡；特异性激活和抑制Shh信号通路活性能够分别促进和抑制KC中cyclin D1和Bcl2的表达。
　　2.在正常KC中，Shh信号通路能够激活MEK/ERK信号通路，而对PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性无明显影响；MEK/ERK的特异性抑制剂U0126能够阻断Shh信号通路对KC增殖和凋亡的调控，并阻断Shh通路诱导的cyclin D1及Bcl2的表达。
　　3. EFGR信号通路可通过影响Shh信号通路转录因子Gli-1、Gli-2的稳定性及其受体分子（同时也是靶分子）Ptch-1的表达来调节Shh通路活性；联合调控Shh通路和EGFR信号通路可协同诱导ERK1/2的活化和cyclin D1与Bcl2的表达。
　　结论：
　　1. Shh信号通路通过诱导cyclin D1与Bcl2的表达调控正常KC增殖与凋亡。
　　2. Shh信号通路能够激活正常KC中的MEK/ERK信号通路，而对PI3K/AKT、JAK/STAT1及JAK/STAT3等通路活性无明显影响。
　　3. MEK/ERK通路的激活为Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡所必须，Shh信号通路依赖于MEK/ERK信号转导途径调控KC的增殖与凋亡及cyclin D1与Bcl2的表达。
　　4. Shh信号通路与EGFR通路可协同诱导MEK/ERK通路的激活和cyclin D1与Bcl2的表达，且EGFR信号通路对Shh通路活性具有调节作用。
　　综上所述，本研究首次提出并发现MEK/ERK信号通路是Sonic hedgehog信号转导途径调控人正常KC增殖与凋亡的重要分子机制，为系统阐明Sonic hedgehog信号通路调控KC增殖及凋亡的分子机制开辟了新视角，并为最终明确KC增殖和凋亡的调控机制以及KC异常性皮肤病的发病机制提供了重要的理论依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、角质形成细胞增殖及凋亡异常与皮肤病

二、角质形成细胞增殖与凋亡调控机制的研究现状

三、Sonic hedgehog（Shh）信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响

第一部分 实验材料

1 仪器

2 主要试剂

3 主要试剂配制

4 细胞株

第二部分 实验方法

1 观察Shh信号通路在正常KC中的活性及特异性调控Shh通路对KC增殖及凋亡的影响

2 探讨Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制

3 探讨Shh通路与EGFR通路在正常KC增殖与凋亡调控中的作用关系

第三部分 实验结果

1 Shh信号通路在正常KC中处于激活状态并调控KC的增殖与凋亡

2 Shh信号通路调控正常KC增殖与凋亡的分子机制

3 Shh信号通路与EGFR通路在正常KC增殖与凋亡调控中的作用关系

第四部分 讨 论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢