同轴静电纺丝法制备芯-壳结构pEGFP-N1-BMP-2/PLGA质粒复合材料及其相关研究

摘要

基因活化基质（gene activated matrix，GAM）是将可降解生物支架材料与质粒DNA载体相结合，形成一种基因局部释放系统。GAM既能够提供一个具有一定机械强度、可降解的多孔支架供细胞长入，为种子细胞提供空间支持；又可以通过支架材料直接承载基因如质粒DNA或基因质粒与转染试剂的混合物，继而局部转染种子细胞，分泌促进组织修复的生长因子，特异性诱导种子细胞的定向分化，最终促进组织的再生。
　　静电纺丝是一种制备纳米级纤维的方法。通过静电纺丝制备的纤维膜具有比表面积高、孔隙率大等优点，类似于天然细胞外基质的结构，有利于细胞的粘附、生长、繁殖。传统的静电纺丝方法制备GAM，需将可降解高分子材料与包含质粒的质粒载体混合在一起。电纺过程中质粒不可避免的会接触到有机溶剂，这对质粒的活性有一定影响。此外，混纺形成的纳米纤维支架中的基因释放较快，存在突释效应。
　　本研究选择同轴静电纺丝方法来制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）与骨形成蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein-2，BMP-2）质粒微球的芯壳型纤维，构建壳层是PLGA，芯层是BMP-2质粒微球的铅笔样纳米纤维结构，旨在制备一种兼有良好生物相容性和缓释效果的GAM。
　　研究目的：
　　通过同轴静电纺丝技术，制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA）与BMP-2质粒微球的芯壳型纤维，在此基础上检测纤维的微观形貌及理化
　　性能，并与人牙周膜干细胞共培养，检测生物相容性并测量转染效率及BMP-2表达，为今后GAM进一步应用提供研究基础。
　　研究方法：
　　1、双酶切载体，扩增目的片段，构建 pEGFP-N1-BMP-2重组质粒，PCR/测序鉴定质粒。大量扩增、提取重组质粒。
　　2、同轴静电纺丝法制备PEI/PLGA纤维，确定适合同轴电纺的参数范围。同轴静电纺丝法制备 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维，检测纤维的微观形貌、理化及降解性能。
　　3、原代培养人牙周膜干细胞，HE染色观察细胞形态，流式细胞术鉴定干细胞表面分子标志物，成骨成脂定向诱导后染色验证其多向分化能力。将牙周膜干细胞与pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维共培养，检测生物相容性，激光共聚焦显微镜观察转染情况，测量转染效率及BMP-2表达情况。
　　研究结果：
　　1、经双酶切后得到大小约4.7 kb线性化载体，PCR得到1191bp目的基因片段。将线性化载体和目的基因片段连接后得到重组质粒，PCR可以扩增出大小约1.4 kb的基因片段，测序结果与GeneBank中人BMP-2转录本序列（NM_001200）完全吻合，酶切位点完整。
　　2、制备的同轴PEI/PLGA纤维直径均匀、大于PLGA纤维，相互交错成网状，激光共聚焦显微镜下可观察到同轴结构。强度极限和弹性模量小于 PLGA纤维。同轴 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维比混纺 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维、PLGA纤维表面光滑程度下降。透射电镜下可观察到质粒微球在纤维中央。同混纺的pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维及 PLGA纤维相比较，孔隙率没有区别，而接触角介于混纺 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维、PLGA纤维之间。吸水率比混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维低，力学强度也相对较差。降解则比混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA电纺纤维更平稳。
　　3、酶消化法、有限稀释法成功分离得到人牙周膜干细胞，有一定克隆形成能力，流式细胞仪显示符合干细胞特性，具有向成脂、成骨等不同方向分化的潜能。将同轴 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维膜与牙周膜干细胞共培养，牙周膜干细胞在纤维膜表面伸展充分，生长状态良好。MTT测试表明同轴pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维膜比混纺 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维膜有更小的细胞毒性。激光共聚焦显微镜下都可观察到绿色荧光蛋白，然而混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维膜的荧光减少更快。流式细胞仪显示同轴 pEGFP-N1-BMP-2/PLGA转染效率逐渐高于混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA。同轴pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维BMP-2表达量普遍高于混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维，仅有4h组比混纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA纤维略低。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、前言

二、静电纺丝技术基础

三、静电纺丝组织工程支架与生物活性分子传递的研究进展

四、挑战与展望

五、总结

实验一 重组质粒pEGFP-N1-BMP-2的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 同轴电纺芯-壳型pEGFP-N1-BMP-2/PLGA的制备及表征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 同轴电纺pEGFP-N1-BMP-2/PLGA体外转染牙周膜干细胞实验

1 仪器与材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢