调控微环境改善大鼠骨髓间充质干细胞骨再生效能的实验研究

摘要

骨髓间充质干细胞是骨缺损修复的前提条件，如何提高骨髓间充质干细胞在骨缺损区域再生中发挥的作用，是研究缺损修复的核心问题。我们设计实验，利用骨组织工程支架材料搭载小干扰RNA及局部应用神经肽等多种方法调控细胞微环境，进而提高大鼠骨髓间充质干细胞的迁移，分化和增殖能力。
　　实验一壳聚糖搭载两种小干扰RNA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨成血管分化的作用
　　目的：将两种分别促进成骨和成血管的siRNA同时搭载到壳聚糖凝胶中，制成新的骨组织工程支架材料，研究此种新型支架材料对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。
　　方法：制备壳聚糖凝胶，用脂质体2000搭载siCkip-1和siFlt-1、单独搭载siCkip-1、单独搭载siFlt-1，搭载siNC导入壳聚糖凝胶中，将大鼠骨髓间充质干细胞接种至之前4组搭载siRNA的支架材料及不搭载任何siRNA的壳聚糖凝胶中，观察这五组支架材料对骨髓间充质干细胞增殖和分化的作用。
　　结果： RT-qPCR分析显示siCkip-1+siFlt-1组中ALP、OCN以及VEGF的表达显著高于其余四组，有统计学差异（P＜0.05），免疫荧光染色的结果显示，siCkip-1+siFlt-1组的 osteocalcin和von Willebrand factor高表达，显著高于其余4组，有统计学差异（P＜0.05）。
　　结论：siCkip-1和siFlt-1同时载入壳聚糖会发生协同作用，显著增强骨髓间充质干细胞成骨成血管能力。
　　实验二体内植入搭载两种小干扰RNA的壳聚糖对大鼠颅骨缺损修复的作用
　　目的：将实验一中的已经证实可以在体外促进骨髓间充质干细胞成骨成血管的支架材料植入大鼠体内，研究其对颅骨缺损修复的作用。
　　方法：将实验一中制备的5组支架材料分别植入15只大鼠的颅骨缺损区域，三个月后处死大鼠，Micro-CT三维重建骨缺损区域，分析新生骨组织的骨密度和骨体积分数。Van Gieson染色观察骨组织变化。
　　结果：siCkip-1+siFlt-1组与其余4组相比，显著提高缺损区骨的再生（P＜0.05）。
　　结论：壳聚糖搭载siCkip-1和siFlt-1所构建的骨组织工程支架材料能够促进大鼠骨缺损的再生修复。
　　实验三 CGRP对大鼠间充质干细胞迁移，增殖和成骨分化的影响
　　目的：SDF-1在细胞迁移的过程中发挥重要作用，因而我们研究 CGRP对体外培养的骨髓间充质干细胞分泌SDF-1的作用，以及CGRP对骨髓间充质干细胞迁移，增殖和成骨分化的影响。
　　方法：将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种在CGRP浓度为10-7M的培养基、CGRP8-37浓度为10-7M的培养基以及普通培养基中，ELISA检测三组BMSCs中SDF-1的分泌和表达，Transwell实验检测三组BMSCs的迁移能力，BrdU免疫荧光实验检测三组BMSCs的增殖能力，RT-qPCR检测三组BMSCs的成骨相关基因的表达。
　　结果：每组各个时间点BMSCs都有SDF-1mRNA的分泌和表达，而在第3、5天时，三组之间两两都有统计学差异（P＜0.05），Transwell实验结果显示三组均有穿膜 BMSCs，CGRP组的穿膜细胞显著多于对照组，对照组显著多于CGRP8-37组，两两之间均有统计学差异（P＜0.05），BrdU染色显示CGRP组中处于DNA合成期的细胞显著多于对照组，而对照组的阳性细胞亦显著多于CGRP8-37组，且两两之间均有统计学差异（P＜0.05）。三组BMSCs每个时间点均有ALPmRNA和Runx2表达，在14天时达到峰值 CGRP组显著高于其余两组，对照组显著高于CGRP8-37，两两之间均有统计学差异（P＜0.05）。
　　结论：体外实验中，CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞的迁移，增殖和成骨分化有促进作用。
　　实验四局部注射降钙素基因相关肽CGRP对SD大鼠下颌骨单侧牵张成骨效果的影响
　　目的：利用局部注射CGRP的方式研究CGRP对于大鼠牵张成骨效果的影响。
　　方法：30只大鼠全麻下右侧下颌骨植入牵张器并截断下颌骨，随机分为三组，在牵张期10天中，分别局部注射0.2ml10-7M浓度CGRP、CGRP8-37及生理盐水。固定2周后处死动物，Micro-CT分析新生骨密度及骨体积分数，HE染色观察组织形态学。
　　结果：Micro-CT分析结果显示三组牵张区均有不同程度的新骨形成，三维重建后分析BMD以及BV/TV，CGRP组明显高于其它两组，且两两间均有统计学差异（P＜0.05）。HE染色显示三组动物牵张区均有新骨形成，而 CGRP组骨小梁显著多于其余两组，且两两间均有统计学差异（P＜0.05）。
　　结论：局部注射外源性 CGRP可以促进牵张区骨再生。
　　实验五局部注射CGRP对下颌骨牵张中间充质干细胞动员的作用
　　目的：通过检测牵张时局部间充质干细胞和外周血中间充质干细胞的数量，以及SDF-1的表达，来研究局部应用CGRP对于间充质干细胞动员的作用。
　　方法：手术同实验四，在牵张器植入5、6、11、15、22、29天，流式细胞法检测外周血CD29阳性细胞数量，ELISA检测外周血SDF-1含量，qRT-RCR检测牵张区SDF-1mRNA的表达。并在处死动物后，免疫组化检测新生骨区Nestin表达。
　　结果：CGRP组牵张区 Nestin阳性细胞显著多于其余两组，SDF-1mRNA表达亦显著高于其余两组，两两之间有统计学差异（P＜0.05）。术后5、6、11、15、22、29天六个时间点采得的外周血均有CD29阳性细胞，均有SDF-1的表达，且在达到峰值时，CGRP组显著高于其余两组，两两之间有统计学差异（P＜0.05）。
　　结论：牵张区局部注射CGRP可以促进局部及全身间充质干细胞向牵张区动员。

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前言

文献回顾

1 骨组织工程研究进展

2 牵张成骨研究进展

3 降钙素基因相关肽CGRP在骨代谢中发挥的作用

4 降钙素肽家族其它成员在骨代谢中作用的研究进展

5 微环境是骨髓间充质干细胞增殖和分化的关键因素

实验一 壳聚糖搭载两种小干扰RNA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨成血管分化的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 体内植入搭载两种小干扰RNA的壳聚糖对大鼠颅骨缺损修复的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 CGRP对大鼠间充质干细胞迁移，增殖和成骨分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 局部注射降钙素基因相关肽CGRP对SD大鼠下颌骨单侧牵张成骨效果的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 局部应用CGRP对下颌骨牵张中间充质干细胞动员的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢