肿瘤代谢相关基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌预后相关性研究及其机制

摘要

据最新流行病学数据显示，肺癌已经成为最为常见的恶性肿瘤，2012年全球肺癌新发病例约180万，占新增癌症病例总数的13％，已成为男性中发病率和死亡率最高的癌症，在女性中发病率排第三位，死亡率排第二位。肺癌中约80%是非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC），由于我国肺癌筛查手段不足，难以做到早期诊治，使得75%左右的NSCLC患者发现时已处中晚期，加上肺癌治疗方法不够规范和先进，仅有少数患者可通过手术获益，造成了非小细胞肺癌的5年生存率较低，为此找到有效的分子标志物用于NSCLC患者的早期诊治及预后评估，对于提高肺癌患者的总体生存期具有重要意义。
　　NSCLC治疗的首选方案和最主要的治疗方法是外科手术。为了提高肺癌外科手术的治愈率和患者的生存率，常常需在术前或术后进行辅助化疗、放疗等治疗。晚期NSCLC患者因不能手术或不宜手术，临床上建议采用放疗，放、化疗结合综合治疗也是目前局部晚期NSCLC广泛应用的治疗策略。然而，由于肿瘤异质性的特点，采用同一种治疗方案的不同患者疗效差异显著，为了解决这个问题，个体化医疗的概念被提出，但目前临床中仍缺乏有效的区分不同患者个体差异的标志物，难以有效的区分患者个体差异实施个体化治疗。目前，利用肿瘤细胞与正常细胞在分子、细胞水平差异，针对细胞受体、基因及调控分子等信号传导为药物靶点的分子靶向治疗应用已成为当前肺癌临床应用研究领域的热点，但可以应用到临床实践的标志物仍然很少。
　　单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因组中由单个碱基变异或短片段插入缺少而引起人群中 DNA序列的多态性，变异在人群中达到一定频率（大于1%）。随着SNP研究的深入，已发现多个癌基因或抑癌基因中SNP与包括肿瘤在内多种疾病发生、发展密切相关，另有SNP也可用于肿瘤化疗疗效评估。在NSCLC中已发现部分与患者预后密切相关的SNP，但数目较少，且利用单个位点进行评估时效果有限，为此寻找更多的可用于NSCLC预后评估的SNP位点，制定联合分析策略，在NSCLC个体化治疗中具有重要意义。
　　代谢异常是肿瘤重要特征之一，早在20世纪30年代，生物化学家Otto Warburg就发现即使在氧供充分的条件下肿瘤细胞依然保持旺盛的糖酵解，消耗大量葡萄糖。陆续研究发现肿瘤代谢重编程与肿瘤进展密切相关。目前，肿瘤中已发现多条代谢通路发生改变包括糖代谢、核苷酸代谢、线粒体能量代谢等影响生命活动的重要代谢通路。对于这些通路中关键基因的研究，寻找肿瘤特异的标志物，有利于NSCLC临床个体化治疗开展。
　　目的：本研究以代谢通路关键基因为目标，寻找并证实与NSCLC患者预后密切相关的SNP标志物，为临床个体化治疗提供更多策略。
　　方法：入组病例来自第四军医大学唐都医院胸外科，经过剔除后最终入组500例NSCLC患者进行研究。通过SEQUENOM MassArray基因质谱仪对上述样本中代谢物转运基因、三羧酸循环通路关键基因、糖代谢相关基因、核苷酸合成代谢基因共计15个基因43个SNP位点进行基因分型检测，并结合患者临床信息，采用Cox比例风险回归模型、Kaplan-Meier法、Log-rank秩和检验、生存树分析等多种统计方法分析SNP不同基因型与NSCLC患者预后之间的相关性，并利用TCGA公共数据进行基因差异表达和拷贝数分析。
　　结果：研究发现，在NSCLC中代谢物转运相关基因CD98 SNP位点rs1059292 WV+VV型患者与WW型患者相比，死亡风险显著升高，并且rs1059292 WV+VV型患者与WW型患者相比，促进肿瘤生长以及淋巴结转移，该位点突变型可促进CD98基因转录增强。另一个基因MCT1 SNP位点rs1049434突变型患者与野性型患者相比死亡、复发风险均显著降低，MCT2基因SNP位点rs995343 VV型患者与WW+WV型患者相比死亡风险升高。
　　还发现三羧酸循环通路关键酶基因SDHC SNP位点rs12064957 WV+VV型NSCLC患者与WW型患者相比，死亡风险显著降低。IDH2基因SNP位点rs11540478在Additive模型下，突变型患者死亡风险显著升高。另外，FH基因rs1414493位点WV+VV型患者与WW型患者相比，死亡风险显著升高。生存树分析发现rs1414493位点对患者死亡影响最大，rs4932158对患者复发影响最大。
　　NSCLC患者中糖代谢相关基因GPI2个SNP位点rs7248411，rs8191356 VV型患者与WW+WV患者相比死亡、复发风险均显著降低。2个SNP位点基因型进行累积效应分析发现危险基因型对患者死亡、复发风险随危险基因型个数增加而具有递增趋势。用肿瘤分化级别、TNM分期分层后GPI基因2个SNP位点仍与患者预后密切相关。
　　核苷酸合成代谢基因TYMSSNP位点rs2847153 VV型NSCLC患者与WW+WV患者相比复发风险显著升高。rs2847153 WW+WV型患者中，术后化疗患者与未化疗患者相比死亡、复发风险均显著下降。另一个核苷酸代谢基因RRM2B SNP位点rs2290707和rs2853231 VV型患者与WW+WV患者相比复发风险均显著降低。
　　结论：①代谢物转运基因CD98、MCT1、MCT2中rs1059292、rs1049434、rs995343可用于NSCLC患者预后评估；②三羧酸循环通路基因中rs12064957、rs11540478、rs1414493等位点或可作为NSCLC患者早期预后不良的重要指标；③糖代谢相关基因GPI中 rs7248411，rs8191356不同基因型与NSCLC患者预后密切相关；④核苷酸代谢基因TYMS、RRM2B中rs2847153、rs2290707和rs2853231位点可作为NSCLC患者预后评判的指导依据。

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文献回顾

1、非小细胞肺癌及相关分子标志物研究进展

2、单核苷酸多态性（SNP）的研究进展

3. 肿瘤代谢相关基因研究进展

第一部分 非小细胞肺癌样本、信息收集及功能性SNP位点选择与基因分型检测

1. 非小细胞肺癌样本收集

2．样本临床信息收集及预后分析

3．功能性SNP 位点筛选

4．基于SEQUENOM MassARRAYTM飞行质谱仪的功能性SNP分型检测

5. 主要实验仪器及试剂

第二部分 代谢物转运相关基因 CD98，MCT SNP 与非小细胞肺癌预后研究及其机制

1 血液样本采集及临床资料的准备

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 三羧酸循环通路关键基因SNP与非小细胞肺癌预后研究及其机制

1 血液样本采集及临床资料的准备

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 糖代谢相关基因GLUT1，GPISNP与非小细胞肺癌预后研究

1 血液样本采集及临床资料的准备

2 方法

3 结果

4 讨论

第五部分 核苷酸合成代谢基因 TYMS，RRM2B SNP 与非小细胞肺癌预后研究

1 血液样本采集及临床资料的准备

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢