转位蛋白18KDa配体ZBD-2神经保护作用及治疗产后抑郁的实验研究

摘要

研究背景:
　　产后抑郁症（postpartum depression,PPD）是最常见的分娩并发症。是女性分娩后，由于社会角色、体内激素水平、外界刺激等变化所带来情绪紊乱。调查显示，大约15-20％的产妇将会经历各种不同程度的PPD症状。症状包括快感缺乏，睡眠障碍，悲伤，绝望，认知障碍等。PPD不仅严重影响孕产妇的身心健康，而且对婴幼儿情绪、智力发育、行为发展等方面具有很大的消极影响。因此，对PPD的干预和治疗显得尤为重要。但是PPD的发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明，缺乏针对性治疗措施。
　　兴奋性突触传递与抑制性突触传递的平衡是大脑中枢神经系统（Central nervous system,CNS）发挥正常功能的基础。谷氨酸（glutamic acid, Glu）作为CNS中最重要的兴奋性神经递质，它的过量释放将导致兴奋性神经毒性的发生，继而诱导神经元死亡。N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体是离子型谷氨酸受体，在哺乳动物的CNS中，NMDA受体介导的快速兴奋性神经传递参与了广泛的生理和病理过程。NMDA受体作为一个潜在的神经保护的“传感器”，参与了神经元存活，神经元树突、轴突结构发育及突触可塑性的形成。此外，NMDA受体与记忆的形成和保持密切相关，所以NMDA受体在神经元损伤的神经系统疾病中备受关注。已有文献报导TSPO通过减少小胶质细胞活化介导神经元保护作用，然而TSPO是否参与调控谷氨酸兴奋性毒性尚不清楚。
　　γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是脑内最重要的抑制性神经递质，其功能紊乱与产后抑郁发病关系密切。研究表明，孕期孕激素的大量增加，分娩后的急剧减少对GABAAR产生相当大的影响。分娩前孕激素的高水平状态使产妇神经元中GABAAR与苯二氮?结合率降低，神经活动的抑制性下降，兴奋性增高，孕妇容易出现负面情绪。而产后孕激素大幅下降使去甲肾上腺素能、多巴胺能神经系统对机体的兴奋性降低，GABA能神经系统的抑制性相对增强，最终导致 CNS功能下降，表现出意志力低下，思维能力、记忆力减退，从而增加PPD的易患性。提示：GABAR是抗PPD药物的重要靶点。
　　杏仁核（amygdala），附着在海马的末端，呈杏仁状，是边缘系统的一部分。是产生情绪，识别情绪，调节情绪及控制学习和记忆的脑部重要组织。杏仁核根据结构和功能被分为三部分，侧核（lateral amygdala,LA）、基底外侧核（basolateral amygdala,BLA）和中央核（central amygdala,CeA）。其中BLA是杏仁核复合体最大的核，是神经可塑性发生的关键结构，也是情感输入的重要枢纽。通过钙调蛋白激酶标记检测，BLA主要由Glu能神经元和形态相似的皮层锥体神经元以及少量GABA能中间神经元组成。如果 BLA在发育初期出现缺陷，很可能导致后期出现精神障碍，如恐慌，害怕等。杏仁核与皮质之间有着广泛的往返纤维联系，这些联系主要参与记忆、情绪活动的调节。
　　转位蛋白18KDa（Translocator protein,TSPO）是五次跨膜结构域蛋白，广泛分布于中枢和外周组织细胞线粒体外膜上。TSPO参与胆固醇从线粒体膜外到膜内的转运，是类固醇及神经甾体合成的限速步骤，而神经类固醇作为调控情绪和应激反应的重要因素，提示TSPO可能参与精神系统疾病的发生发展过程。研究发现，TSPO配体XBD173具有良好的抗焦虑作用而没有苯二氮?类药物的副作用。此外，重复使用XBD173未发现啮齿类动物的戒断症状。我们实验室在XBD173分子结构基础上，进一步优化以增加血脑屏障通过率，合成了化合物（C27H27N5O2）ZBD-2（专利号：201210047188.6），发现ZBD-2与TSPO亲和力高，水溶性良好，对慢性痛引起的焦虑具有良好的治疗作用。然而，ZBD-2对兴奋性神经毒性损伤以及产后抑郁症的干预作用尚不清楚。
　　研究目的:
　　首先阐明TSPO配体ZBD-2对脑缺血再灌注和NMDA诱导的神经毒性的保护作用及机制。接着深入考察TSPO配体ZBD-2对 PPD模型小鼠行为学的影响，检测TSPO在PPD模型小鼠BLA区的表达差异，利用分子生物学等手段揭示激活TSPO调控BLA中GABA能抑制性传递发挥抗PPD的作用机制。为治疗PPD药物的研发提供新靶点，为PPD的治疗提供新策略。
　　研究方法：
　　第一部分：体外培养原代皮层神经元，建立NMDA细胞损伤模型；建立体内大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，评价ZBD-2的神经保护作用。原代皮层神经元在培养至第10天的时候，分别给予1μM和10μM的ZBD-2，孵育24小时后，用200μM的NMDA处理30min，换用完全培养液（含ZBD-2）继续培养24小时后收集细胞。用MTT法检测细胞的活力表现，用Hoechst/PI双染法检测细胞的凋亡状况。小鼠腹腔给药第7天时，进行MCAO损伤实验。用2% TTC染色检测小鼠大脑冠状剖面损伤体积的变化；用Nissl染色法检测前额叶皮质与海马神经元细胞损伤情况；用蛋白免疫印迹（Western blot,WB）方法观察NMDA受体GluN2A、GluN2B，及Bcl-2、Bax、和pro-caspase-3蛋白含量变化。
　　第二部分：采用激素模拟妊娠状态（hormone-simulated pregnancy,HSP）后激素突然撤停的方法制备PPD模型，评价ZBD-2对PPD的治疗作用。采用旷场（open field test，OF）、高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）、糖水偏好（Sucrose preference test,SPT）、悬尾（Tail suspensiontest,TST）和强迫游泳（forced swimming test, FST）等实验方法，检测ZBD-2激活TSPO后，PPD小鼠行为学的改变；免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）实验检测TSPO在基底外侧杏仁核（BLA）的表达；HE染色法检测激活TSPO对BLA区神经元形态的影响；ELISA方法检测TSPO对下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamo-pituitary-adrenal,HPA）激素和单胺类递质5-HT含量的影响；WB法观察激活 TSPO对脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB），以及对兴奋性神经神经递质Glu受体和抑制性神经递质GABA受体表达的影响。
　　结果：
　　第一部分：
　　1.ZBD-2通过减少 NMDA受体GluN2B表达，降低Bax/Bcl-2比值，上调pro-Caspase-3水平，从而减少NMDA引起的兴奋性毒性损伤，具有促进细胞存活和抑制细胞凋亡的作用。
　　2.ZBD-2可以减少大脑梗死体积，改善神经功能缺损评分以及改善小鼠额叶皮层和海马区神经元的形态。
　　第二部分：
　　1. TSPO在正常小鼠BLA高表达，ZBD-2对PPD小鼠BLA神经元具有保护作用。
　　2. ZBD-2可以缓解PPD模型小鼠抑郁样行为，作用机制与调控HPA轴激素、增强5-HT分泌、降低兴奋性突触蛋白表达、激活GABAAR、促进BDNF-CREB信号系统表达、调节神经元可塑性密切相关。
　　结论：
　　本研究表明，TSPO配体ZBD-2对NMDA受体介导的兴奋性毒性损伤具有神经保护作用。TSPO在正常小鼠BLA高表达，在PPD小鼠BLA表达显著下降。PPD小鼠灌胃给药ZBD-2一周后，具有明显的抗PPD作用。机制研究发现，ZBD-2激活TSPO后，通过调控HPA轴，增强5-HT分泌，降低兴奋性突触蛋白表达，促进GABAA受体表达和调节神经可塑性发挥抗PPD作用。
　　本研究首次发现TSPO配体ZBD-2具有神经保护作用；揭示ZBD-2激活TSPO具有抗PPD的作用，为抗PPD药物的研发提供了新靶点，为PPD的临床治疗提供了新策略。

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缩略语表

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文献回顾

第一部分 转位蛋白 18KDa 配体 ZBD-2 对脑缺血再灌注和NMDA诱导的神经毒性的保护作用机制研究

1. 材料

2. 实验方法

3. 结果

4 讨论

第二部分转位蛋白18KDa配体ZBD-2在产后抑郁治疗中的机制研究

1. 材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

小结

全文研究结论：

研究创新点：

拟研究的问题：

参考文献

个人简历和研究成果

致谢