TonEBP信号通路在海水吸入型急性呼吸窘迫综合征发病机制中的作用研究

摘要

研究背景：
　　海水淹溺是在航海、海上作业及海洋军事行动中经常发生的意外事故。海水吸入后，通过直接或间接作用导致肺部炎症和肺水肿，如不及时控制极有可能发展成为海水吸入型急性呼吸窘迫综合征（Seawater Inhalation Induced Acute Respiratory Distress syndrome，SW-ARDS）并最终导致死亡。已有的研究结果证实炎症、肺水肿和细胞凋亡等参与 SW-ARDS的发生，但目前的研究成果尚未形成针对性的理论体系，这也是SW-ARDS救治成功率未能大幅提高的主要原因。
　　与创伤、脓毒症、烟雾吸入等造成的急性肺损伤相比，高渗联合缺氧刺激是SW-ARDS的显著特点。高张反应增强结合蛋白（TonEBP），也称为活性T细胞核转录因子-5（NFAT5），是 Rel家族的同源转录因子，也是哺乳动物体内唯一已知的受渗透压调节的转录因子。TonEBP介导的渗透压调节信号通路在SW-ARDS发病中的作用如何？干预此信号通路后对SW-ARDS病情的影响如何？这都是研究SW-ARDS发病机制和治疗策略亟待解决的科学问题，对于阐明TonEBP介导的渗透压调节通路在SW-ARDS中的关键作用、开创针对性的干预措施具有指导意义。
　　研究目的：
　　1.探讨TonEBP信号通路在SW-ARDS大鼠和细胞模型中的表达变化；
　　2.对比配方海水、高渗NaCl溶液和LPS刺激引起细胞损伤的差异，探索针对于SW-ARDS的以TonEBP信号通路为核心的发病机制；
　　3.探讨TonEBP通过调节Na+, K+-ATP酶活性和表达参与调控海水刺激时肺水肿的机制。
　　研究意义：
　　本课题以海水高渗这一最显著的特殊属性为切入点，提出并验证TonEBP信号通路是SW-ARDS发病机制中的关键环节；相关研究明确海水刺激时肺组织中TonEBP信号通路介导高渗适应、炎症反应和肺水肿的机制，并在一定程度上说明此信号通路的异常活化是 SW-ARDS特殊性的原因所在。为进一步完善海水吸入型肺损伤发病机制理论和开辟新的临床治疗方案提供了一种新的思路。
　　实验方法：
　　1.动物实验
　　健康雄性SD大鼠（180-220 g）完全随机分为空白对照组（Control）和海水刺激1、2、4、6、8、12小时组。除空白对照组外，其它各组大鼠均按照 SW-ARDS研究惯用的方法制备动物模型，并在相应的时间点取肺组织标本。分别在大鼠吸入海水后0、1、4、6、8、12小时检测和分析大鼠动脉血气，评价吸入海水后大鼠肺功能的变化；在处死各组大鼠前30分钟向血管内注入伊文思蓝，并在放血处死大鼠后进行肺循环灌流，而后收集肺组织标本检测肺组织中伊文思蓝含量，以评价肺血管通透性变化。取大鼠吸入海水0、1、4、6和12小时后肺组织标本制备病理切片，观察大鼠肺损伤程度；取大鼠吸入海水0、1、4、6、8、12小时后肺组织检测肺组织中Na+, K+-ATP酶活性变化；取大鼠吸入海水0、2、4、6、8和12小时后肺脏进行肺泡灌洗，检测肺泡灌洗液中蛋白和细胞含量；取大鼠吸入海水0、2、4、6、8和12小时后肺组织标本，以ELISA的方法检测肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量；采用Western blot的方法检测海水刺激0、2、4、6、8和12小时后肺组织标本中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB、Na+, K+-ATPase-α1和Na+, K+-ATPase-β1的蛋白表达。
　　2．细胞实验
　　（1）将处于对数生长期的A549细胞随机分为空白对照组（Control）和海水刺激1、2、4、6小时组。用浓度为25％的配方海水刺激细胞并在相应的时间点收集标本，采用ELISA的方法检测细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量；采用Western blot的方法检测细胞各组细胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表达量。
　　（2）不同浓度海水刺激A549细胞：将处于对数生长期的A549细胞分为正常对照组、5%海水组、15%海水组、25%海水组和35%海水组。不同浓度的海水刺激细胞4小时后，采用Real-time PCR的方法检测细胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表达的变化；
　　（3）不同浓度NaCl溶液干预A549细胞：用不同浓度的NaCl溶液干预处于对数生长期的A549，所用NaCl溶液的浓度分别为0（Control）、5%、10%、15%、20%和25%。不同浓度的NaCl溶液刺激细胞4小时后，采用Real-time PCR的方法检测细胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表达的变化；
　　（4）不同浓度LPS干预A549细胞：用不同浓度的LPS干预处于对数生长期的A549，干预的浓度依次为0（Control）、0.001 ng/ml、0.01 ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml；不同浓度LPS的培养基刺激细胞4小时后，采用Real-time PCR的方法检测细胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表达的变化；
　　（5）海水、NaCl溶液和LPS作用对比研究：将处于指数生长期的A549细胞分为：空白对照组（Control）、25%配方海水组（Seawater）、25% NaCl溶液组（NaCl）和10 ng/ml LPS组（LPS），上述浓度的溶液刺激海水4小时后收集细胞并提取细胞蛋白；采用Western blot的方法检测细胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表达量。
　　（6）海水刺激导致细胞损伤的机制研究：用p38 MAPK抑制剂（SB203580，5μM）及TonEBP或NF-κB siRNA预处理A549细胞4小时；而后将细胞分为：空白对照组（Control）、25%配方海水组（Seawater）、25% NaCl溶液组（NaCl）和10 ng/ml LPS组（LPS）；上述溶液刺激细胞4小时，提取细胞蛋白和RNA，采用Western blot的方法检测细胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表达量；采用Real-time PCR的方法检测细胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表达。
　　（7）海水刺激对细胞中Na+,K+-ATP酶影响的研究：将指数生长期的A549细胞分为空白对照（Control）组、25%海水刺激2 h、4 h、6 h和8 h组；在相应的时间点对细胞进行拍照，观察和记录细胞形态和体积的变化；收集相应时间点的细胞标本，检测细胞中Na+,K+-ATP酶活性的变化；提取相应时间点细胞蛋白检测细胞中Na+,K+-ATPase-α1、Na+,K+-ATPase-β1及TonEBP蛋白表达的变化。此外，用TonEBP siRNA预处理A549以相同的方式干预细胞并观察细胞中Na+, K+-ATP酶活性及蛋白表达的变化
　　实验结果：
　　（1）海水刺激导致大鼠血气结果的恶化、肺组织结构损伤、血管通透性增加以及肺实质内中性粒细胞的聚集和炎症因子的释放；上述变化在吸入海水后6小时最为明显，之后逐步好转。另外，海水刺激造成肺组织中p38 MAPK信号通路的激活，同时伴有TonEBP和NF-κB及下游分子的表达。此外，体外实验结果也证实海水的上述效应。
　　（2）配方海水、高渗NaCl溶液和LPS刺激时都导致A549细胞中TNF-α、IκBα和MCP-1基因表达增高；但是相同浓度的配方海水的刺激作用强于高渗NaCl溶液；并且，相同浓度的配方海水对A549细胞中AR、BGT1和SMIT基因表达的促进作用也强于NaCl溶液。然而，LPS刺激时A549细胞中TNF-α、IκBα和MCP-1基因表达量增加，但是LPS刺激对AR、BGT1和SMIT基因的表明无明显影响。在机制研究方面，配方海水、高渗NaCl溶液和LPS刺激均能够促进A549细胞p38 MAPK信号通路的异常表达；同浓度的配方海水对p38 MAPK信号通路的激活作用强于高渗NaCl溶液；更重要的是，同浓度的配方海水对TonEBP及其下游的渗透压调节相关蛋白的活化作用也明显强于高渗NaCl溶液。LPS刺激导致A549细胞中p38 MAPK信号通路的异常表达和炎症因子的释放；但是，LPS刺激对TonEBP的激活作用极弱，也无法促进其下游渗透压调节相关蛋白的表达。此外，特异性地抑制p38 MAPK信号通路时不能完全逆转上述三种刺激对细胞的损伤作用。采用siRNA抑制TonEBP的表达后可明显抑制配方海水与高渗NaCl对细胞的损伤作用，而对LPS的损伤效应的影响不明显。更为重要的是，siRNA干预TonEBPR的表达后，高渗刺激无法激活NF-κB的表达；而抑制NF-κB的表达对高渗刺激时TonEBP的表达无明显的影响，说明高渗刺激时TonEBP是NF-κB的上游调控分子。
　　（3）海水刺激增加大鼠肺组织血管的通透性，同时抑制肺组织中Na+,K+-ATP酶的活性；海水刺激致使A549细胞体积缩小，并在刺激6-8小时后造成细胞形态不可逆的变化。此外，动物和细胞实验结果均表明，海水刺激抑制Na+,K+-ATP酶蛋白的表达可能与TonEBP的表达有关。
　　结论：
　　1.TonEBP信号通路参与SW-ARDS的发生发展，TonEBP的表达和活化受到p38 MAPK信号通路的调节。
　　2.配方海水、高渗NaCl溶液和LPS刺激都能够引起细胞中p38 MAPK信号通路的异常活化；配方海水和高渗NaCl溶液对TonEBP及其下游分子表达的影响更为明显，但同比例的配方海水对TonEBP的影响强于高渗NaCl溶液；这说明TonEBP为核心的信号通路是SW-ARDS发病机制中的独特环节。
　　3.TonEBP通过调节Na+,K+-ATP酶的活性和表达参与调控SW-ARDS时肺水肿的发生。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分 急性呼吸窘迫综合征的发病机制

第二部分 海水吸入型急性呼吸窘迫综合征研究进展

第三部分 TonEBP信号通路的研究进展

第一部分 SW-ARDS发生时TonEBP通路活化的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 TonEBP信号通路参与海水刺激时高渗适应和炎症反应的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 TonEBP信号通路参与SW-ARDS时肺水肿的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢