ROS及ERstress信号通路在海水吸入性肺损伤中的作用及其机制的研究

摘要

背景：
　　淹溺是一个十分重要但是又经常被人们所忽视的公共健康问题，在全球范围内，淹溺是引起死亡的最常见原因之一。海水的化学组分复杂，还含有丰富的细菌和藻类，因此，海水淹溺的后果更为严重，引起海水吸入性急性肺损伤(seawater drowning-induced acute lung injury，SW–ALI)以及海水吸入性急性呼吸窘迫综合征（seawater drowning-induced acute respiratory distress syndrome，SW-ARDS）。发生SW–ALI时，海水可直接作用于肺泡上皮细胞，引起上皮细胞凋亡及炎性因子产生，肺泡结构紊乱，肺泡及间质发生水肿，导致通气/血流比例失调，气体交换障碍，机体发生低氧血症及酸中毒。
　　机体在受到不良外界刺激时，细胞内内质网蛋白折叠功能受损，激活内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress），同时活性氧类（reactive oxygen species,ROS）水平升高。ER stress与ROS在细胞增殖、凋亡及转化过程中扮演重要角色，但其在SW–ALI/SW-ARDS中的作用及其机制还属未知。本实验通过建立海水吸入性肺损伤大鼠模型，研究ER stress与ROS在海水吸入性肺损伤中的作用，并深入探讨其可能的作用机制。
　　目的：
　　通过建立海水吸入性肺损伤大鼠模型以及海水干预人肺泡上皮来源A549细胞，观察海水对肺泡上皮细胞的损伤以及对肺泡上皮细胞凋亡的影响，研究ER stress与ROS在海水吸入性肺损伤中的作用及其机制。
　　方法：
　　1.动物实验：65只健康雄性SD大鼠随机分为①正常对照组、2h海水组，4h海水组，6h海水组，8h海水组；②正常对照组，海水组，NAC组，NAC+海水组；③正常对照组，海水组，4-PBA组，4-PBA+海水组。向大鼠气管内滴注海水建立SW–ALI大鼠模型，通过肺组织湿干重比（W/D）检测及肺组织病理学检查评价肺水肿及肺损伤情况，TUNEL染色检测肺组织凋亡情况，Western Blot检测GRP78及CHOP蛋白表达情况，免疫组织化学染色检测GRP78表达情况。
　　2.细胞实验：①用20％，40%，60%，80%海水刺激A549细胞4h；②25%海水刺激A549细胞2h，4h，6h，8h；③加入海水之前2h加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或ER stress抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）预处理，以毒胡萝卜素(Thap)作为海水的阳性对照。CCK-8检测海水刺激对A549细胞生长抑制情况，流式细胞技术检测细胞凋亡，活性氧荧光探针（DCFH-DA）检测细胞内ROS水平，Western Blot检测GRP78、CHOP、p-JNK、p-PERK、p-IRE1、p-50ATF6、caspase-3蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.动物实验：海水吸入后，大鼠肺组织W/D值显著增加，HE染色可见肺泡结构紊乱，肺泡塌陷，肺泡壁增厚，提示海水吸入引起ALI。同时TUNEL染色结果显示海水引起肺泡上皮细胞凋亡且NAC、4-PBA预处理能减少细胞凋亡。Western Blot检测发现海水吸入可引起GRP78及CHOP蛋白表达增加。免疫组织化学染色结果显示4-PBA预处理可减少GRP78蛋白表达。
　　2.细胞实验：CCK-8检测 A549细胞生长抑制情况及流式细胞计数检测细胞凋亡结果显示海水刺激可抑制A549细胞生长及促进凋亡发生，DCFH-DA检测细胞内ROS水平显示海水可引起 ROS产生增加，且均呈海水浓度及作用时间依赖性。Western Blot检测结果显示海水也可引起GRP78及CHOP表达增多。NAC预处理不仅降低ROS水平也可减少GRP78，p-50ATF-6，p-IRE1，p-PERK、CHOP、p-JNK及caspase-3表达，并减轻海水引起的细胞生长抑制及细胞凋亡程度。4-PBA预处理不仅减少GRP78及CHOP表达，也可降低ROS水平及p-JNK、caspase-3的表达，同时减轻海水引起的细胞生长抑制及细胞凋亡程度。
　　结论：
　　海水可引起肺泡上皮细胞损伤及凋亡，并可激活ER stress信号通路、升高ROS水平。同时ER stress与ROS之间相互作用，形成恶性循环，共同介导肺泡上皮细胞凋亡，在SW-ALI病理过程中发挥重要作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一 淹溺

二 海水吸入性肺损伤

三 内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress）

1 CHOP介导的ER stress引起的细胞死亡

2 BCL2介导的ER stress引起的细胞死亡

3 IRE介导的ER stress引起的细胞死亡

4 Caspase介导的ER stress引起的细胞死亡

四 活性氧类（reactive oxygen species, ROS）

五 ER stress与ROS的关系

1 ROS可扰乱内质网蛋白折叠引起ER stress。

2 ER stress可引起ROS水平升高

实验一 ER stress与ROS在大鼠海水吸入性肺损伤中的作用

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器与试剂Power Pac 300电泳仪

1.3 主要试剂配制

2 方法

2.1 实验动物分组

2.2 实验动物的处理以及SW-ALI大鼠模型的建立

2.3 大鼠肺组织湿干比（W/D）检测

2.4 大鼠肺组织病理学染色（HE法）

2.5 大鼠肺组织GRP78免疫组织化学染色

2.6 肺组织GRP78及CHOP蛋白Western Blot检测

2.7 大鼠肺组织细胞凋亡检测（TUNEL）

2.8 统计分析

3 结果

3.1 海水吸入对大鼠肺组织湿干比（W/D）的影响

3.2 海水吸入后肺组织形态学变化（HE染色）

3.3 海水吸入对肺组织细胞凋亡的影响

3.4 NAC预处理对肺组织细胞凋亡的影响

3.5 海水吸入后ER stress相关蛋白表达量变化情况

3.6 4-PBA预处理对 GRP78免疫组织化学染色的影响

3.7 4-PBA预处理对肺组织细胞凋亡的影响

4 讨论

实验二 ER stress与ROS在海水诱导人肺泡上皮A549细胞损伤中的作用

1 材料

1.1 细胞株

1.2 主要仪器与试剂

1.3 主要试剂配制

2 方法

2.2 实验分组及处理

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI 双染法）

2.4 Western Blot检测A549细胞内p-PERK、PERK、p-IRE1α、IRE1、p-50ATF6、GRP78、CHOP、p-JNK、JNK 和 caspase-3的表达情况。

2.5 细胞内活性氧的荧光探针检测法（DCFH-DA）

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 不同浓度海水作用不同时间以及相同浓度海水作用不同时间对 A549 细胞生长的影响

3.2 不同浓度海水作用不同时间以及相同浓度海水作用不同时间对 A549 细胞凋亡的影响

3.3 海水刺激对A549细胞内ROS水平的影响

3.4 ROS在海水引起的A549细胞生长抑制以及细胞凋亡的作用

3.5 Western Blot检测NAC预处理对A549细胞p-JNK及caspase-3表达的影响

3.6 Western Blot检测海水刺激对A549细胞GRP78及CHOP表达的影响

3.7 Western Blot检测4-PBA预处理对A549细胞GRP78及CHOP表达的影响

3.8 ER stress在海水引起的A549细胞生长抑制以及细胞凋亡的作用

3.9 Western Blot检测4-PBA预处理对A549细胞p-JNK及caspase-3表达的影响

3.10 Western Blot 检测NAC 预处理对海水引起的A549 细胞ER stress 通路激活的影响

3.11 DCFH-DA 检测4-PBA 预处理对海水引起的A549 细胞ROS 水平升高的影响

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢