肠道病毒感染后婴幼儿咽部菌群分析

摘要

背景：上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI）是儿童的常见病、多发病，多由病毒感染引起，细菌感染常继发于其后，机制不明。肠道病毒（Enterovirus，EV）是引起URTI最常见的病原体之一，流行于春末、夏季和秋初。轻者可引起普通感冒、疱疹性咽峡炎和手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）等，重者甚至能导致急性心力衰竭、重症肺炎、急性迟缓性脊髓炎和败血症等。由于目前尚没有有效的抗病毒药物和疫苗，每年大范围的流行给各国家和地区带来了巨大的经济负担，因此，寻找一种有效的预防或治疗EV感染的方法具有重要意义。
　　呼吸道定植着大量细菌，在长期与人类共同进化的过程中，这些细菌与宿主机体形成了一个互利共生的状态。它们被称为正常菌群，参与宿主抵御感染、营养获得、免疫成熟和神经调节等过程。大量研究表明，肠道微生物菌群在病毒入侵时可能发挥双重作用，即促进或者抵御病毒感染，运用宏基因组学方法筛选得到的一种或者若干种细菌可作为益生菌治疗疾病或者改善症状。然而，当EV入侵时，呼吸道菌群承担着怎样的角色尚属未知，我们拟运用16S rDNA测序技术对EV感染后的婴幼儿咽部菌群进行分析，以揭示EV与上呼吸道菌群的相互作用，阐明其致病机制为EV感染的治疗提供新思路。
　　方法：1.在第四军医大学西京医院儿科门诊随机收集符合入组条件的患儿的临床资料和口咽拭子，入组条件为：1）由儿科主治医师诊断为URTI；2）1月内未服用抗生素、益生菌和激素等；3）平素体健，1月内未患任何感染性疾病；4）自愿参与调查并签署知情同意书。在西京医院预防保健科募集正常对照，其入组条件参照病例组（第一条除外）。运用Copan ESWAB标本运送系统采集样本，采用Epidata软件设计问卷并录入临床资料。2.运用Luminex xTAG? RVP FAST试剂盒检测呼吸道病毒。3.若EV为阳性，则提取样本的全基因组DNA，扩增细菌16S rDNA V3-V4区，搭载 Illumina Miseq平台进行测序，用生物信息学方法分析数据。4.运用 SPSS17.0作统计学分析，用GraphPad Prism5作图。
　　结果：1.2015年5-7月期间，本课题共募集到96名URTI患儿和15名健康婴幼儿。96个URTI样本中，79例检出病毒，病毒检出率为82.29％，其中EV、EV+其他病毒混合感染、除EV外其他病毒混合感染、副流感病毒2型、副流感病毒3型，冠状病毒OC43分别占37.50%、11.46%、9.38%、6.25%、5.21%和5.21%。以3岁以下EV感染的婴幼儿为研究对象，共24位感染者，平均年龄19.17月，男:女=14:10；15位健康对照的平均年龄为19.27月，男:女=10:5。此外，我们还随机选取了3名EV+其他病毒混合感染的婴幼儿和3名年龄大于3岁的儿童的咽拭子进行了菌群改变的初步探索。
　　2.Illumina Miseq测序并对原始序列处理后，共获得1,120,649条高质量的16S rDNA序列，平均每个样品（共45个样品）24,903条序列。
　　1）EV感染组较健康对照组，口咽部菌群多样性降低，p=0.482，差异无统计学意义。在门水平，EV感染组梭杆菌门丰度显著增加，p=0.0098，FDR=0.0098；在属水平，假单胞菌属丰度降低，p=0.0293，FDR=0.0293，孪生球菌属和无类别的纤毛菌属丰度明显增加，前者 p=0.0034，FDR=0.0102，后者 p=0.0192，FDR=0.0288。孕周、生产方式、喂养方式、白细胞数、中性粒细胞百分比对肠道病毒感染组样本的菌群构成的影响没有统计学意义。
　　2）EV感染组内，无疱疹组较有疱疹组和对照组，菌群多样性下降， p值依次是0.0111，0.0392。在物种丰度分析中，有疱疹组和无疱疹组菌群结构在门水平和属水平均没有明显差异。
　　3）混合感染组较 EV感染组菌群多样性显著降低，p=0.0020，梭杆菌门相对丰度降低，p=0.0409，菌群构成个体差异大。
　　4）大于3岁儿童咽部菌群的多样性较婴幼儿明显降低，p=0.0062。属水平表现为链球菌属相对丰度降低，p=0.0229。
　　结论：1.2015年5-7月，西安地区引起儿童URTI的病毒以EV、副流感病毒2型、副流感病毒3型和冠状病毒OC43等为主。
　　2. EV感染后，婴幼儿咽部菌群多样性降低，无类别的纤毛菌属和孪生球菌属丰度显著增加，假单胞菌属丰度相对降低，这可能为益生菌通过调节咽部菌群构成来治疗EV感染提供新思路。

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缩略语表

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文献回顾

一 肠道病毒

1. EV的生物学特性和致病性

2.EV的预防和治疗

二 微生物菌群在病毒感染时的作用

1 健康人的呼吸道菌群构成

2 病毒与微生物菌群研究进展

三 微生物群落研究的技术发展

一 材料与方法

1 样本和临床资料收集

1.1 URTI患儿和健康对照入组和排除标准

1.2 样本采集

2 病毒核酸抽提及检测

2.1主要试剂

2.2主要仪器

2.3病毒核酸抽提

2.4病毒检测

3 细菌基因组DNA提取及16S rDNA测序

3.1主要试剂

3.2主要仪器

3.3实验步骤

4 生物信息学数据分析

4.1数据处理

4.2操作分类单元分类

4.3赋予物种分类单元

4.4基于OTU和物种分类的分析

5 统计学分析

二 结果

1 病例资料及病毒检测结果

2 细菌基因组提取结果

3 特异性扩增16S rDNA V3-V4区结果

4 生物信息学分析

4.1 16S rDNA分析结果

4.2菌群结构分析

三 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢