Mcl-1参与NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性调控的实验研究

摘要

Mcl-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）是Bcl-2（B cell lymphoma-2, Bcl-2）抗凋亡蛋白家族成员，参与调控细胞的凋亡与存活。Mcl-1在许多正常组织中广泛表达，对维持多种细胞的成熟与分化具有重要的意义。Mc l-1表达的上调提示了肿瘤的发生，而在多种人类癌组织中，Mcl-1确实存在过表达现象。此外，Mcl-1的过表达还可以诱导细胞对一些治疗药物产生耐受作用。由此可见，作为癌症靶向新型位点，Mcl-1在诱导肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤方面可能发挥重要的作用。本实验以含EGFR突变的PC-9细胞系以及含 EML4-ALK基因融合的H3122细胞系为研究对象，观察Mcl-1调控NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性的作用及相关机制。
　　第一部分：通过Western blot方法，检测EGFR抑制剂和ALK抑制剂诱导NSCLC细胞凋亡信号通路以及凋亡过程中起关键作用的调控分子。结果显示：EGFR和ALK抑制剂通过调控Bcl-2家族蛋白的表达，活化Caspase-3信号途径，进而诱导NSCLC细胞凋亡，Mcl-1则作为参与此凋亡信号通路的一个关键分子。
　　第二部分：观察Mcl-1调控NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性的作用。实时定量PCR、Western blot以及免疫共沉淀实验等检测Mcl-1的表达，结果显示GFR和ALK抑制剂并非在转录水平下调Mcl-1，而是在蛋白降解水平下调Mcl-1。过MTT实验检测到临床上还有一些EGFR野生型病人对Gefitinib敏感，而对这些efitinib敏感型细胞给予Gefitinib处理后Mcl-1表达下调。Westernblot检测对efitinib敏感细胞及耐药细胞给予Gefitinib处理后中Mcl-1的表达及细胞的凋亡情，结果发现随着药物浓度的增大，敏感细胞株凋亡片段增多，Mcl-1表达减少；而药细胞株未出现明显的凋亡片段，Mcl-1的表达无明显减少。特异性敲除耐药细胞Mcl-1基因，流式细胞技术检测细胞，结果显示细胞凋亡明显增多。
　　第三部分：探讨Mcl-1调控EGFR突变细胞对EGFR抑制剂敏感性的相关机制。Western blot检测分别给予Gefitinib、Akt抑制剂以及Erk抑制剂处理后，PC-9细胞内Mcl-1的表达情况，结果发现：EGFR抑制剂通过下调pAkt来抑制pGSK3β的表达，使Mcl-1磷酸化水平增加，进而被泛素修饰，并经泛素化途径降解。通过免疫共沉淀以及Western blot实验验证：FBW7是介导Mcl-1泛素化修饰的泛素连接酶，下调FBW7的表达可以抑制Mcl-1蛋白的降解。

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前言

文献回顾

一、肺癌

二、细胞凋亡

三、Bcl-2家族

第一部分 EGFR和ALK抑制剂诱导NSCLC细胞凋亡的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 Mcl-1参与EGFR和ALK抑制剂敏感性调控的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 Mcl-1 调控 EGFR 突变细胞对EGF R抑制剂敏感性的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢