miR-375在乙肝相关性肝癌的疾病进程中的表达及其临床意义

摘要

肝细胞肝癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，病程进展快，病死率逐年攀升。在我国乙型肝炎病毒（HBV）的感染是HCC最主要的病因之一。HCC早期症状隐匿，中、后期治疗效果差，预后不良。迄今为止，灵敏度或特异度不足是HCC诊断标志物存在的普遍问题，虽然近年也有一些新的血清学标志物的研究，但在临床应用上仍有一定的局限性，用于对慢性HBV感染发展到HBV相关性肝癌的疾病进程进行预测就更难以实现。因此，急需寻找与HBV慢性感染到癌变过程密切相关的，有较高特异性和敏感性的血清学标志物，并探讨其调控作用。这将有助于临床上HCC患者的早期发现和治疗，并对改善肝癌患者的预后，提高生存率具有重要意义。
　　microRNAs（miRNAs）是一类长度约22nt的内源性单链非编码RNA小分子，可以对基因进行转录后调控。研究发现 miR-375在各种恶性肿瘤中呈低表达，它的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。miR-375对肝癌细胞的增殖、侵袭有抑制作用，但缺乏进一步的流行病学现场研究来分析miR-375在健康人群、HBV慢性感染者、肝硬化到HBV相关性肝癌发生、发展过程中的表达水平；血清中和肝癌组织中miR-375的差异表达与患者HBV血清标志物、肝癌相关的临床检测指标等的相关性如何也未见报道。因此，本研究以现场研究和实验室研究相结合，检测从健康人群、慢性乙肝感染、肝硬化发展到乙肝相关肝癌进程中血清 miR-375的差异表达，分析血清和肝癌组织中miR-375表达水平与疾病进展、肝癌临床检测指标、HBV感染相关指标等的相关性；同时在HepG2细胞平台上，通过miR-375增强表达探讨其对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。本研究将进一步阐明肝癌发展的分子调控网络，为肝癌的疾病进展的预测提供线索。
　　【方法】
　　1.人群肝癌组织实验部分：于2014年8月至2015年8月在西京医院收集进行手术治疗的HBsAg阳性HCC患者为研究对象，采集患者肝癌组织和癌旁正常组织进行实验。利用自行设计调查表收集研究对象人口学信息和临床资料，通过 qRT-PCR对组织miR-375进行检测，使用ELISA法检测乙肝五项。分析比较肝癌组织与癌旁正常组织miR-375表达水平的差异，以及肝癌组织miR-375表达水平与肿瘤分期、大小、数目、常用肿瘤标志物以及HBV血清标志物等之间的相关性。
　　2.人群血清研究部分：2014年10月至2015年2月，在唐都医院感染科收集HBV相关性疾病患者；同期于第四军医大学校直门诊部收集健康对照；并且将第一部分HBV相关性HCC患者的血清学标本也纳入研究。采集血液标本，使用统一调查表收集基本信息和临床资料，通过qRT-PCR检测miR-375和HBV DNA，使用ELISA法检测乙肝五项。比较健康对照、慢性乙型肝炎无肝硬化患者、肝硬化患者以及HBV相关性肝癌患者的血清miR-375表达水平的差异，分析其与患者HBV血清标志物、肝癌临床检测指标等的相关性，并绘制ROC曲线，分析miR-375对HBV相关性HCC的诊断效能。
　　3.细胞研究部分：选择能够稳定复制 HBV的肝癌细胞 HepG2.2.15和其亲本HepG2进行实验，通过qRT-PCR检测两株肝癌细胞miR-375表达水平的差异。利用体外转染 miR-375 mimic上调其表达，采用 CCK-8法、细胞划痕实验和 Transwell实验分析miR-375的过表达对HepG2和HepG2.2.15细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
　　4.统计学分析：采用Epidata3.1软件建立数据库，使用SPSS19.0分析数据，计量资料使用t检验、方差分析或Mann-Whitney U检验进行统计分析，计数资料使用卡方检验进行统计分析，相关性使用Spearman相关性分析，P＜0.05为有统计学意义。
　　【结果】
　　1.人群肝癌组织实验部分：纳入HBV相关性HCC研究对象43例，肿瘤数目平均为1.24±0.58个，肿瘤大小平均为5.99±2.58 cm。
　　①HBV相关性肝癌患者肝癌组织中miR-375表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.001）。
　　②分析肝癌组织miR-375的表达与HBV血清学标志物的相关性结果显示：HBV DNA阳性的患者肿瘤组织miR-375的表达水平显著低于HBV DNA阴性患者（P＜0.05）；抗-HBc阳性患者肝癌组织中miR-375的表达水平显著低于抗-HBc阴性患者的水平（P＜0.001）。
　　③肝癌组织miR-375的表达与HCC患者临床特征分析结果显示：男性患者肝癌组织miR-375的表达水平显著低于女性患者（P＜0.05）；存在肝硬化的HCC患者肝癌组织miR-375的表达水平显著低于无肝硬化的HCC患者（P＜0.05）；CA19-9出现升高的HCC患者肝癌组织中miR-375的表达水平显著低于CA19-9正常的患者（P＜0.05）。
　　2.人群血清研究部分：纳入研究对象177例，其中健康对照40例，慢性乙型肝炎无肝硬化患者20例，HBV肝硬化患者54例，HBV相关性HCC患者63例。
　　①健康人群血清中miR-375的表达量最高，而慢性乙型肝炎无肝硬化患者、肝硬化患者和HCC患者的血清miR-375水平依次降低。
　　②分析血清miR-375的表达与HBV血清学标志物的相关性结果显示：血清miR-375在HBeAg阳性患者中的表达水平显著低于阴性患者（P＜0.05）；抗-HBe阴性患者血清miR-375表达水平显著高于抗-HBe阳性的患者（P＜0.05）；血清miR-375在HBV DNA阳性患者中的表达水平显著低于HBV DNA阴性的表达水平（P＜0.05）。
　　③分析血清miR-375的表达水平与HBV相关性患者肿瘤标志物的相关性，结果显示：血清miR-375在AFP和CEA阳性患者中表达水平均低于阴性患者（P＜0.05）。
　　④绘制ROC曲线，结果显示：miR-375从全部研究对象中诊断出HBV相关性HCC患者的灵敏度为73.9％，特异度为93.0%， AUC为0.838（95%CI：0.780~0.897）；分别使用miR-375和AFP从HBV相关性疾病患者中诊断出HCC患者，前者灵敏度为93.8%，特异度为63.9%，AUC为0.768（95%CI：0.644~0.891），后者灵敏度为75.0%，特异度为65.5%，AUC为0.584（95%CI：0.456~0.713）。
　　3.细胞研究部分：
　　①与HepG2细胞相比，miR-375在表达HBV全基因组的HepG2.2.15细胞中呈现低表达（P＜0.05）。
　　②CCK-8实验结果显示：细胞miR-375过表达后的增殖速度小于未转染的细胞；转染和未转染的HepG2.2.15细胞的增殖速度均小于转染和未转染的HepG2细胞。
　　③划痕实验结果显示：与转染细胞相比，未转染的肝癌细胞出现迁移现象；转染后的HepG2.2.15细胞形态发生变化，贴壁能力比转染后的HepG2细胞弱。
　　④Transwell实验结果显示，转染上调miR-375的细胞侵袭数目明显少于未转染细胞；分析转染后的HepG2和HepG2.2.15细胞侵袭数目，发现过表达后，HepG2细胞侵袭细胞数目高于HepG2.2.15细胞。
　　【结论】
　　1.HBV相关性HCC患者肿瘤组织中miR-375的表达显著低于癌旁正常组织，肿瘤组织miR-375的表达水平与抗-HBc以及HBV DNA滴度呈负相关关系。
　　2.健康对照者血清miR-375的表达水平最高，随着HBV相关疾病进程的发展，血清miR-375的表达水平逐渐降低，在HBV相关性HCC患者血清中达到最低水平，这将为肝癌的疾病进展的预测提供重要线索。血清miR-375的表达水平与HBeAg、抗-HBe、HBV DNA、AFP以及CEA存在相关性。
　　3.血清miR-375可以作为肝癌的辅助诊断指标，对HBV相关性HCC患者的检出具有较高灵敏度和特异度。
　　4.与HepG2细胞相比，miR-375在HepG2.2.15细胞中呈下调表达。通过体外miR-375的增强表达，miR-375能够有效地影响HBV的复制，并抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，发挥着类似抑癌基因的作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、肝细胞肝癌

二、microRNAs在肿瘤中的研究进展

三、HBV相关miRNAs的研究现状

第一部分 miR-375在HBV相关性肝癌组织中的表达及其与临床特征的关系

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 miR-375在HBV相关性肝脏疾病患者血清中的表达水平及与相关临床特征的关系

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 miR-375在肝癌细胞系的表达及对其生物学功能的影响

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢