红景天苷和PTX对氯气致大鼠急性肺损伤干预作用及相关机制研究

摘要

背景：
　　氯气属于窒息性毒剂，是一种首先在战争中使用的化学武器。在第一次世界大战的伊普雷战役中，德军首次在现代战争中使用氯气作为化学战剂，造成15000英法联军中毒，约5000人死亡。氯气还可作为化工原料，广泛用于造纸、纺织等工业生产中，现在常用于杀虫剂、漂白剂、氯碱工业、溶剂、消毒剂、颜料、塑料、合成纤维的制造等，也在医院、游泳池、自来水消毒以及制药业、皮革业、造纸业、印染工业等方面被广泛应用。氯气中毒事故频发，中毒人数众多，可导致呼吸道刺激症状，急性肺损伤（acute lung ingury，ALI），肺水肿，急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome， ARDS）甚至窒息死亡。氯气中毒主要以吸氧、抗炎等对症支持治疗为主，缺乏特效防治药物与有效救治措施[1,2]。
　　氯气暴露后，通过呼吸道侵入机体并溶解在肺泡上皮内衬液（epithelial lung lining fluid，ELF）中，引起呼吸道黏膜损伤，病情严重时，容易引发肺水肿，导致心血管循环功能障碍甚至导致死亡。内皮细胞（endothelial cell，EC）作为组织与血液间的第一道屏障，直接感受血管内环境的改变，并能做出相应的反应；氯气损伤可引发缺氧，EC通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量自由基，引起EC氧化损伤；同时由于自由基的攻击，EC清除自由基的能力减弱，加重损伤；自由基很可能是氯气引起 EC通透性升高的信号传递物质。此外，氯气中毒可诱导多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)和巨噬细胞等炎症细胞在肺泡毛细血管内膜等部位聚集，释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）和多种炎症介质，引起肺泡毛细血管通透性增加，形成间质或肺泡水肿。本课题将在明确氯气损伤主要机制的基础上，从抗氧化、改善循环的角度切入，验证中毒机制的同时，为氯气中毒特效防治药物研究与有效救治措施制订理论依据和提供研究思路。
　　方法：
　　1．氯气致大鼠急性肺损伤的时间效应关系研究
　　给予大鼠400 ppm氯气，染毒5 min，分别在染毒后0h、0.5 h、1.5 h、3 h、6 h、9 h处死动物，取血清、肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid， BALF）和剩余肺组织，采用光镜与透射电镜观察中毒大鼠肺损伤的病理表现，生化比色方法测定氯气损伤后肺通透性与氧化损伤的时间效应关系，Western blot法测定肺组织中血管损伤相关蛋白表达水平，探讨氯气致大鼠肺损伤效应并选取损伤干预观察时间点。
　　2．红景天苷或己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）对氯气致急性肺损伤的保护作用
　　24只SD大鼠随机分为4组，分别设为阴性对照组、氯气暴露组、红景天苷干预组及单纯红景天苷对照组（或PTX干预组及单纯PTX对照组），在染毒前15 min和染毒后30 min给予300 mg/kg红景天苷或100 mg/kg PTX灌胃，在大鼠染毒后3 h分别取血清、BALF和剩余肺组织，生化比色方法测定肺通透指数、LDH等肺通透性变化相关指标以及ROS、MDA、SOD、GSH、GSSG等氧化损伤相关指标的变化，并检测肺组织中Na+K+ATPase和 Ca2+Mg2+ATPase活性，Western blot法检测抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT的蛋白表达水平，缺氧相关蛋白HIF-1α、VEGF、occludin、E-Cadherin的表达水平，自噬相关蛋白LC3、Beclin1、PINK1、Parkin蛋白的表达水平；分离提取肺线粒体蛋白和细胞质蛋白分别检测PINK1和Parkin的表达水平。观察红景天苷或PTX对氯气致大鼠急性肺损伤的干预作用，并比较两种药物的干预效果。
　　3．PTX在内皮细胞线粒体损伤中的保护机制研究
　　利用 t-BHP建立氧化损伤的细胞模型，给予 PTX进行干预处理，MTT法观察t-BHP对HUVECs作用的时间和剂量效应关系，筛选t-BHP的作用时间和半数致死浓度（LC50）。Mito Tracker Green、Mito SOX和Rho123荧光染色观察t-BHP对细胞线粒体的影响。随后观察了1、2、5和10μg/mL PTX干预对细胞活力的保护作用，光镜下观察PTX对细胞形态的保护作用。生化比色法测定LDH活力和MDA、GSH、GSSG、SOD等氧化损伤相关指标以及ATP、ATPase等线粒体损伤相关指标的变化；Clark氧电极测定耗氧量的变化；Western blot法检测SOD1、SOD2、CAT等氧化损伤相关蛋白、PINK1、HIF-1α等缺氧相关蛋白表达水平。观察PTX干预作用分子机制的同时，评价PTX在氯气致ALI中的防治效果。
　　结果：
　　1．400 ppm×5 min氯气暴露条件下，氯气暴露后3 h，大鼠肺体积显著增大，肺血管内皮线粒体脊断裂，呈空泡样变性，氯气暴露后0.5 h-3 h，肺组织炎细胞浸润，肺组织间隙水肿液渗出，肺泡融合断裂，肺通透性升高，出现明显肺损伤。表明肺损伤模型复制成功。在氯气暴露后1.5 h-3 h，大鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液及血清中呈现氧化应激现象，表明在肺水肿形成前大鼠体内发生了一定程度的氧化损伤。随暴露后时间的延长，紧密连接蛋白 E-cadherin与 occludin的异常表达与肺损伤程度呈一定的相关性，氯气引起的肺损伤中肺血管通透性的增加与紧密连接蛋白的异常表达有关。
　　2．给予红景天苷或PTX干预可显著降低大鼠因氯气暴露引起的肺通透性升高；药物干预后，通过降低MDA、GSSG含量、肺组织蛋白SOD1、SOD2和CAT的表达量，升高GSH/GSSG比值，减轻氧化损伤；显著降低缺氧相关蛋白HIF-1α、VEGF、occludin的表达，上调 E-caherin蛋白表达水平，下调 ATP依赖性 Na+K+ATPase和Ca2+Mg2+ATPase活性；此外，药物干预后，自噬相关蛋白LC3 II/LC I比值、Beclin1的表达水平上调，下调肺组织 PINK1、Parkin、线粒体 PINK1蛋白表达水平，升高线粒体蛋白Parkin表达水平。比较两种药物使用效果，PTX在药物使用剂量与拮抗范围方面优于红景天苷。
　　3．采用105μmol/L t-BHP共孵育6 h成功制作氧化应激细胞模型。荧光染色结果显示线粒体 ROS水平上升，线粒体膜电位和线粒体数量下降。Clark氧电极检测结果显示耗氧量下降，生化比色法结果显示ATP和ATPase活力明显下降；Western blot法测定Parkin、HIF-1α、VEGF表达水平显著升高，分离细胞线粒体和胞质蛋白，观察到t-BHP引起PINK1在线粒体上表达量上调，细胞质中表达量下降。1μg/mL PTX即可提高细胞活力，下调 Parkin、HIF-1α、VEGF的表达，升高耗氧量、ATP水平和ATPase活力，减轻细胞缺氧程度和保护线粒体功能。
　　结论：
　　体内实验结果显示，氯气暴露后3 h，肺损伤加重，伴随氧化损伤和缺氧。红景天苷或PTX可能通过降低氧化应激水平，改善缺氧，影响自噬水平，有效改善氯气中毒引起的ALI。通过比较红景天苷和PTX的干预效果，发现PTX药效优于红景天苷。体外实验结果显示， PTX干预可降低氧化损伤，改善缺氧，保护线粒体，减轻ALI。
　　PTX可能的保护作用机制为：（1）通过清除ROS，减轻氧化损伤、下调线粒体PINK1转位水平，保护线粒体功能，同时上调ATP水平、ATPase活力，改善细胞内外离子紊乱，减轻肺水肿；（2）改善缺氧，下调 HIF-1α、VEGF蛋白表达水平，减轻紧密连接蛋白损伤，保护肺血管内皮通透性，对氯气损伤发挥有效作用。本研究在明确氯气中毒的氧化损伤机制的同时，为氯气中毒急救药物的筛选提供基础实验数据，为突发性氯气意外泄漏或恐怖活动的应急医学处置提供理论依据。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 氯气

2 氯气损伤机制研究

3 氯气中毒治疗药物研究

1 材 料

1.1 试剂与耗材

1.2 抗体与试剂盒

1.3 主要仪器

2 方 法

2.1 动物分组与模型建立

2.2 血液样品制备

2.3 支气管肺泡灌洗液收集

2.4 肺组织样品收集

2.5 肺组织匀浆制备

2.6 肺组织病理切片的制备

2.7 苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin, HE）染色

2.8 电镜样品制备

2.9 肺通透指数测定

2.10 肺组织ROS水平测定

2.11 丙二醛（MDA）含量测定

2.12 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

2.13 还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定

2.14 氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量测定

2.15 乳酸脱氢酶(LDH)活力测定

2.16 ATP酶活力测定

2.17 细胞培养

2.18 细胞活力测定

2.19 线粒体质量测定

2.20 线粒体膜电位测定

2.21 线粒体ROS测定

2.22 细胞ATP含量测定

2.23 细胞耗氧量测定

2.24 蛋白提取

2.25 蛋白免疫印迹法

2.26 统计学处理

3 结果与讨论

3.1 氯气致大鼠急性肺损伤的时间效应关系

3.2 红景天苷对氯气致急性肺损伤的干预作用研究

3.3 己酮可可碱对氯气致急性肺损伤的干预作用研究

3.4 己酮可可碱对PINK1介导的细胞线粒体保护作用研究

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢