CD147分子在非酒精脂肪肝炎中的表达及作用机制

摘要

非酒精脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前最为常见的肝脏代谢疾病，主要是由肝细胞内脂肪堆积引起，以弥漫性的肝细胞脂肪变性为特征，进而会发展为非酒精脂肪肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化和肝癌。肝细胞死亡和炎症反应是影响NASH病程变化的主要因素，与疾病的严重程度紧密相关，决定着患者不同的临床转归。此外，脂肪代谢、内质网应激、线粒体机能紊乱和细胞因子的释放都参与了这一疾病的进程。肝实质细胞是肝脏内最多且最容易受到损伤的细胞，也是发生脂肪变性的主要场所。肝细胞的凋亡程度与NASH的严重程度呈正相关，而且肝细胞在受到损伤时会产生相应的危险信号分子，激活炎症通路，释放细胞因子调控疾病的发生发展。
　　CD147也叫Basigin、EMMPRIN，属于免疫球蛋白超家族的成员，是一种跨膜糖蛋白且广泛表达于多种肿瘤细胞及炎症组织中。前期研究表明CD147可以诱导肿瘤细胞和基质细胞分泌基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）通过降解细胞外基质调节肿瘤微环境，促进肿瘤进展，同时参与肿瘤的代谢过程。除此之外，CD147与亲环蛋白（Cyclophilins）等发生相互作用，共同调控了众多免疫性疾病，对于炎性细胞的浸润及促炎细胞因子的释放起到了关键性作用。因此，CD147分子作为生物学靶点可以抑制肿瘤的发生发展和炎症反应。
　　前期CD147分子在肝脏疾病中的研究主要集中在由病毒感染引起的纤维化，硬化及癌变等方面，发现CD147分子的表达参与了肝纤维化的形成，促进了肿瘤的发生。但是对于CD147分子在NASH中的表达情况与作用并不明确，而研究这一问题，对于了解CD147分子在肝脏疾病早期炎症阶段中的作用，在抑制 NASH和逆转NAFLD等疾病治疗中具有重大意义。
　　本课题的研究目的在于探讨CD147分子在NASH肝脏组织中的表达特点；研究了在小鼠肝细胞中特异性敲除该分子对这一疾病产生的影响；探索CD147促进NASH发生发展的重要信号通路及调控分子，为NASH的预防和治疗提供关键的理论依据。
　　第一部分、CD147分子在NASH小鼠模型中的表达
　　首先通过给小鼠喂食胆碱蛋氨酸缺乏（Methionine choline deficient，MCD）饲料，使其能够快速出现NASH的病理特征。对不同时期肝脏组织石蜡切片进行H&E染色，同时检测血清中谷草转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）和谷丙转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）以及组织中相关炎症因子的表达量，评价小鼠模型的建立及各个时期肝脏的脂变情况。结果显示MCD饲料引起了小鼠肝内脂肪沉积以及炎性细胞的侵润，随诱导时间的增长病理改变逐步加剧，并且在病变过程中肝损伤程度加剧。Real-time PCR方法检测了TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-18这些主要炎症因子在小鼠肝脏组织中的表达，结果显示随着诱导时间的增长，炎症因子的表达量随之上升。为确定CD147分子在小鼠非酒精脂肪肝炎中的表达情况，我们提取了各个时期小鼠肝组织总RNA和总蛋白，real-time PCR和Western Blot结果均显示CD147分子在这一病理变化过程中逐渐升高。用肝组织石蜡切片进行CD147分子免疫组化染色，发现正常小鼠肝脏中CD147分子不表达，而随时诱导时间的增长，CD147分子逐渐升高，且主要分布在肝细胞的细胞膜上。在5例正常肝组织及21例肝脂肪变性组织中进行免疫组织化学染色，仅有1例正常肝组织CD147表达阳性，而在脂肪变性患者样本中，16例均有不同程度的CD147分子的表达（p=0.034）。这些结果均提示CD147在非酒精脂肪肝病中高表达并且有可能参与这一疾病的发生发展。
　　第二部分、肝细胞特异性敲除CD147分子抑制NASH的发展
　　利用已建立的肝细胞特异性敲除CD147基因的小鼠诱导NASH至两周，通过肝组织石蜡切片H&E染色、冰冻切片油红O染色以及血清中ALT和AST的检测，可以观察到敲除小鼠肝脏脂肪变性的程度弱于同窝对照小鼠，血清中ALT和AST水平低于同窝对照小鼠。其中，AST具有统计学差异（p＜0.01）。通过对小鼠肝组织石蜡切片进行TUNEL染色，发现敲除鼠相比于同窝对照鼠，肝内细胞的凋亡数量减少。Western Blot检测与凋亡相关的Bax和Bcl-2两个分子，结果显示敲除鼠肝组织内抗凋亡分子Bcl-2上调，促凋亡分子Bax下调，表现出凋亡减弱的趋势。我们通过real-time PCR的方法检测了细胞因子在小鼠肝脏组织中的表达情况，结果显示细胞因子IL-1β和IL-18在敲除鼠中的表达量低于同窝对照鼠，并具有统计学差异（分别为P＜0.05，P＜0.01）。IL-1β和IL-18细胞因子均属于IL-1家族，参与了NLRP3炎性小体在多种疾病的炎症信号转导过程。因此，我们检测了NLRP3分子在小鼠NASH模型中的表达情况，发现该分子在肝脏组织表达升高。进一步检测CD147基因敲除鼠与同窝对照鼠肝脏内NLRP3分子的表达量，Western Blot分析结果证明肝细胞特异性敲除CD147分子后肝脏组织的NLRP3表达量下调。我们分离小鼠原代肝细胞，利用MCD培养基模拟体内NASH的发生。检测诱导后CD147表达量，证明这一诱导过程可以引起CD147分子表达量上调。根据文献，CypA作为损伤相关分子模式（Danger associated molecules pattern，DAMP）可以与其受体CD147调节炎症反应。因此我们检测了C57小鼠血清中Cyclophilin A（CypA）分子表达量，发现在NASH诱导过程中CypA表达量逐渐升高。在体外培养诱导的肝细胞中加入2.0μg/ml的CypA蛋白刺激24h，发现CD147分子与NLRP3分子的表达量也出现上调。上述结果提示，CD147可能与CypA协同参与对炎性小体NLRP3分子的调节。