CD147通过内化循环及贯序水解促进肝细胞肝癌恶性进展

摘要

原发性肝癌俗称“癌中之王”，恶性进展快，治疗难度大，病死率高，是一种非常凶险的疾病，世界范围内肿瘤致死率排名第三位，国内肿瘤致死率的排名第二位，对居民生命健康危害极大。CD147是早期我们科室筛选鉴定的肿瘤药靶分子，CD147在包括肝癌在内多种人类恶性肿瘤中表达，且其高表达是临床不良预后的指标， CD147既可以作为诱导因素，又可以作为效应分子通过不同的机制促进肿瘤细胞的生长代谢，浸润转移，促血管生成，耐药以及死亡抵抗等恶性行为，导致肿瘤进展。生理病理条件下，以跨膜形式定位于细胞膜表面的CD147可以内化进入胞浆而后重新循环到细胞膜上，内化到胞浆的CD147以囊泡形式存在；此外，CD147还可以外泌体的形式或者胞外段被水解后以游离形式（shedding）释放到细胞外基质中。近年来发现，内化循环异常是肿瘤恶性进展过程中获得的表型，这一特点已经逐渐被认可，但是CD147内化循环对于肿瘤进展具有什么意义？同时，CD147水解脱落胞外段之后剩余部分的去向以及有没有生理意义？这些问题的解答有助于进一步揭开CD147在肿瘤中发挥重要意义的神秘面纱，并为以CD147为靶点的药物研发提供理论依据。
　　第一部分，从CD98与肝癌不良预后密切相关出发，首先证实了细胞膜表达的CD98通过β1-integrin及其下游信号通路在肝癌细胞的铺展和成瘤方面具有重要作用；然后基于CD147正向调节CD98的细胞膜表达水平的流式结果，以及证实CD147与CD98相互作用的共定位、pull-down和SPR等实验结果，推测CD147能够调节CD98的细胞膜定位；进而采用K7721细胞过表达荧光蛋白标记的CD98，激光共聚焦结果发现在缺失CD147的情况下，CD98阻滞在内质网以及Rab5阳性的早期内体，而恢复 CD147之后，CD98又可以重新定位到细胞膜上；而进一步实验证实，CD147和CD98的内化步骤，也就是囊泡循环的步骤都是由Flotilin-1介导的，而同时也都受Arf6分子的调节。于是，CD147通过与CD98胞外段直接相互作用实现共转运，呈现协同膜表达的现象，而后促进β1-integrin及其下游信号通路的活化，在肝癌细胞铺展和成瘤方面发挥重要作用。因此，CD147能够调节 CD98的细胞膜定位和囊泡循环机制解释了CD147和CD98的协同作用，并在肝癌进展中具有重要意义。
　　第二部分，从CD147分子的内化现象出发，使用胆固醇抑制剂MβCD在阻断CD147内化之后，流式结果却发现CD147在细胞膜上的表达水平反而下降；通过进一步研究，发现细胞膜胆固醇水平下降之后，ADAM10对CD147的膜外切割作用（shedding）增强，而使用HAb18抗体能够阻断这一过程；在分别阻断蛋白酶体降解途径和溶酶体降解途径之后，发现CD147胞外切割之后剩余的片段会进一步走向溶酶体处理。于是，CD147的胞外切割以及随后的溶酶体降解可能组成了一种CD147的降解途径。但是，也有可能CD147的胞内段在经历贯续水解之后发挥更为重要的生理意义。
　　第三部分，首先分析发现 CD147胞内段存在一个经典的核定位信号序列，且CD147胞内段能够指引融合的荧光蛋白定位到细胞核；然后，我们通过构建GFP-CD147-mCherry载体并转染入HEK293T细胞，发现由于CD147的贯续水解， CD147胞内段能够指引融合的mCherry定位到细胞核；通过自噬诱导、自噬阻断实验，发现CD147胞内段的产生很可能与肝癌细胞自噬过程相关，过表达CD147胞内段之后，肝癌细胞的自噬过程进一步增强；通过荧光报告基因筛选、转录组基因芯片分析以及RT-PCR和Western blot验证，CD147胞内段可能抑制NF-κb活性以及NF-κB-TRAIL-caspase8-ATG3通路使肝癌细胞具有自噬倾向；而具有自噬倾向的肝癌细胞在一定程度上赋予了肝癌细胞化疗药物顺铂抵抗的能力；鉴于HAb18在一定程度上阻断了CD147的贯续水解，发现顺铂联合HAb18能够显著抑制肝癌细胞生长。
　　综上所述，研究证实了CD147通过内化循环促进了CD98的膜定位表达，以及其下游的integrin信号通路，在肝癌细胞的粘附以及裸鼠的皮下成瘤方面发挥了重要作用；通过探寻CD147的贯续水解现象，发现CD147是在ADAM10和溶酶体的联合作用下，实现了分步切割，这可能是细胞蛋白降解维持稳态的机制；最后通过体外过表达CD147胞内段分析发现，具有核定位作用的CD147胞内段通过自噬促进作用增强了肝癌细胞的顺铂耐药能力，HAb18通过抑制CD147的贯续水解，在化疗药物的增敏作用中发挥显著的作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

肝癌现状：发病与治疗

CD147的生物学特性以及在肿瘤中的研究进展

跨膜分子的贯续水解（sequential proteolysis, ectodomain shedding and regulated intramembrane proteolysis）

自噬与肿瘤

第一部分 CD147通过内化循环促进CD98-integrinβ1依赖的肝癌细胞粘附和成瘤能力

1.材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分CD147贯续水解的机制初步研究

1材料

2方法

3结果

4 讨论

第三部分 核定位CD147胞内段（CD147-ICD）促进肝癌细胞自噬

1 材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢