犬瘟热病毒H蛋白基因克隆、原核表达及其重组蛋白的抗原性研究

摘要

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)在分类上属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，是引起鼬科、犬科及浣熊科或其它食肉目犬瘟热病的(Canine distemper, CD)一种单股RNA病毒。CDV主要抗原蛋白的血凝素蛋白(H)，是整个病毒基因组变异率最高的蛋白，其基因序列同源性是CDV基因型的分型依据，并且H蛋白的糖基化能影响病毒的抗原性，因此H全基因的克隆测序分析，对监测犬瘟热的流行病学规律及分析其抗原性有重要的意义。此外，H蛋白是CDV诱导机体产生中和抗体的主要抗原。H蛋白的中和性抗原袁位编码的多肽可刺激机体产生中和抗体，中和CDV。但在犬瘟热病毒感染宿主过程中，不同毒株H蛋白主要抗原表位区域的球状头部域(HeadDomain)的中和性抗原表位变化对毒株间抗原演变或体液免疫机制产生的影响逐渐成为研究热点。本研究主要包括以下三部分: 1犬瘟热H蛋白全基因的克隆及序列分析 CDV野毒株H基因核苷酸序列中有一个或两个NdeⅠ酶切位点，而疫苗株序列中没有这个酶切位点。通过NdeⅠ酶切位点的不同，能区分CDV的疫苗株与野毒株。本研究设计扩增H全基因的一对特异性引物，并利用本实验室已经建立的可区分CDV疫苗株与野毒株RT-PCR-RFLP检测方法，对2011-2013年间水貂、狐狸、犬等临床病例样品感染的CDV进行疫苗株与野毒株区分，对16份确定为野毒株感染的H全基因克隆并送公司测序。应用MegAlign、MEGA5.0、NetNGlyc1.0软件将测序得到的序列与国内外参考毒株比对，包括核苷酸同源性比较、潜在糖基化位点分析、进化树分析等。结果表明，16个测得的H基因编码区全长均为1824bp，与国内外参考毒株H基因编码区核苷酸序列的同源性为91.1％-99.8％，推导的氨基酸序列同源性为89.0％-99.8％，属于野毒株谱系，基因型与国内大部分分离株同属于Asia-1型。 2犬瘟热病毒野毒株LY1206M的动物回归试验 为从水貂典型CD病料样品中分离的一株野毒株，采用病例复制、RT-PCR检测、H基因测序等方法证实分离得到的犬瘟热病毒(CDV)，命名为LY1206M。对这株分离株H基因的核苷酸序列比对显示，LY1206M与疫苗株的同源性为91.0％～91.5％，与国内外分离株的同源性为93.5％～99.9％，由于第306位(H→N)和542位(I→N)的氨基酸突变，该毒株具有11个潜在的糖基化位点。本研究用该毒株成功的对比格犬进行了感染，为后续犬瘟热病毒H蛋白原核表达及攻毒保护试验提供了实验基础。 3犬瘟热病毒H蛋白Head Domam基因的原核表达及重组蛋白的免疫原性研究 本研究以犬瘟热病毒的疫苗株CDV3和野毒株LY1206M基因组RNA为模板，RT-PCR分别扩增得到CDV3和LY1206M的H全基因序列，PCR分别扩增得到CDV3-Head Domain和LY1206M-Head Domain基因，将其片段分别克隆于pET-30a-c(+)载体进行诱导表达，经SDS-PAGE和Western Blot分析表明，这两种Head Domain重组蛋白均获得正确表达，分子质量均约为50.8ku。再将两种重组蛋白分别免疫小鼠，间接ELISA结果表明，这两种重组蛋白均能激发机体产生特异性抗体，具有一定免疫原性。中和试验结果表明，这两种重组蛋白的抗体中和效价差异不显著(P＞0.05)。本研究为进一步研究H蛋白中和抗原表位定位及其体液免疫机制奠定了基础。 本研究成功克隆、表达了犬瘟热H蛋白Head Domain基因，纯化得到了具有强抗原性的重组蛋白，为建立犬瘟热ELISA诊断试剂盒提供了可能，为亚单位疫苗的研制提供了一定依据。

目录

论文说明

声明

摘要

文献综述

1 病原学研究进展

2 诊断技术研究进展

3 临床与病理学研究进展

4 犬瘟热感染的免疫机制研究进展

5 犬瘟热基因工程疫苗研制方面的研究

6 研究的目的及意义

试验一 犬瘟热病毒H基因的克隆与测序分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 N基因PCR扩增

2．2 H基因PCR扩增

2．3 H基因RFLP

2．4 临床样品检测

2．5 重组质粒的PCR鉴定

2．6 重组质粒的酶切鉴定

2．7 序列测定结果

2．8 H基因序列分析

3 讨论

试验二 犬瘟热病毒野毒株LY1206M的动物回归试验

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 分离株的培育

2．2 LY1206M的鉴定

2．3 实验动物临床症状及病理变化

2．4 CDV分离株中外源病毒的检测

2．5 H基因序列比对和系统发育树的绘制

3 讨论

试验三 疫苗株与野毒株H蛋白球状头部域的原核表达及其免疫原性鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 CDV H全基因的扩增及其RFLP分析

2．2 重组质粒的双酶切及测序鉴定

2．3 Head Domain基因的扩增

2．4 重组原核表达载体的构建与鉴定

2．5 Head Domain-His的诱导表达

2．6 表达产物的可溶性分析结果

2．7 最佳诱导浓度的优化结果

2．8 最佳诱导时间的优化

2．9 Head Domain-His的纯化

2．10 Western Blot分析

2．11 间接ELISA检测结果

2．12 中和试验结果

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

英文缩略词表

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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