TLR4/NFκB信号通路在异氟醚预处理减轻电磁脉冲(EMP)脑损伤中的作用机制研究

摘要

随着科技日趋发达，电磁能在人类日常生活广泛存在，电磁辐射对人类健康造成不容忽视的影响与损伤。电磁脉冲（electromagnetic pulse，EMP）是电磁辐射中的一种特殊类型，电磁脉冲暴露会产生一系列生物学效应，现对电磁脉冲辐射的物理防护有大量研究，但其药物防护与治疗方面却研究较少。本实验重点研究了电磁脉冲辐照对大鼠大脑皮层的损伤机制，以及异氟醚预处理对电磁脉冲辐照的脑保护作用。
　　第一部分、EMP对SD大鼠大脑皮层神经元、促炎因子以及Caspase3的影响目的：研究电磁脉冲对大鼠大脑额叶皮层神经元形态数量、促炎因子的分泌以及Caspase3的影响，探究EMP对中枢神经系统（central nervous system，CNS）的损伤机制。
　　方法：将健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组（Control组）和电磁脉冲（EMP组，200kv/m，200个脉冲，连续辐照3天）辐照后1h，6h，24h组，共4组。采用HE染色方法观察电磁脉冲辐照在大鼠额叶皮层神经元的形态学改变。
　　采用酶联免疫吸附实验方法（ELISA）定量检测经电磁脉冲辐照后大鼠大脑额叶皮层促炎因子TNF-α、IL-1β的水平变化。采用蛋白印记法（Western Blotting）半定量检测经电磁脉冲辐照后大鼠脑额叶皮层Caspase3的表达变化。
　　结果：HE染色结果显示：辐照后1h（EMP1h组）、6h（EMP6h组）与24h组（EMP24h组）异常神经元数目较对照组（Control组）均增多（P＜0.05），其中EMP6h组与EMP24h组升高比较明显（P＜0.01），EMP6h组与EMP24h组相比之间无明显差异。
　　ELISA结果显示：EMP辐照后，TNF-α水平随时间逐渐升高，于辐照后EMP6h尤为明显，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），EMP24h组分泌下降；IL-β各实验组表达水平较对照组均升高，于辐照后1h（EMP1h）升高较为明显（P＜0.01）。
　　Western Blotting半定量分析结果显示：经EMP辐照后，各实验组大鼠大脑皮层Caspase3蛋白表达均较对照组增加，其中EMP辐照后6h组（EMP6h）与24h组（EMP24组）增加较为明显（P＜0.01），EMP6h组与EMP24h组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：电磁脉冲辐照会引起大鼠大脑额叶皮层神经元损伤，大鼠大脑皮层促炎因子分泌水平的改变以及Caspase3表达增加。
　　第二部分、EMP对大鼠大脑皮层小胶质细胞与TLR4／NFκB信号通路的影响目的：研究EMP对大鼠大脑皮层小胶质细胞的影响以及其是否通过影响TLR4、NFκBp65的表达而引起神经元损伤，并为下一步实验确定辐照后处理时间点。
　　方法：实验动物分组同第一部分。采用蛋白免疫印记法（Western Blotting）检测经电磁脉冲辐照后大鼠大脑额叶皮层组织小胶质细胞活化标记蛋白CD11b与TLR4、NFκBp65表达水平的变化。免疫荧光染色观察电磁脉冲辐照大鼠大脑额叶皮层TLR4以及NFκBp65表达的影响。
　　结果：Western Blotting半定量分析结果显示：经EMP辐照后6h与24h大鼠大脑皮层CD11b蛋白表达均较假照组增加，其中EMP辐照后6h组（EMP6h）增加较为明显（P＜0.01）；EMP辐照后，TLR4、NFκBp65蛋白水平随时间逐渐升高，辐照后6h组与24h组较对照组差异有统计学意义（P＜0.05），其中辐照后6h组（EMP6h）升高较为明显（P＜0.01）。
　　免疫荧光染色结果显示：EMP使大鼠大脑额叶皮层神经元中 TLR4、NFκBp65表达增多，其中EMP辐照后6h组（EMP6h）与24h组（EMP24h）增加较为明显。
　　结论：电磁脉冲辐照会引起CD11b表达增加，表明电磁脉冲可能会诱发小胶质细胞活化。电磁脉冲辐照会引起大鼠大脑皮层TLR4、NFκBp65蛋白表达增多，表明TLR4/NFκB通路有可能参与了电磁脉冲造成神经元损伤的过程。
　　第三部分、TLR4／NFκB信号通路在异氟醚预处理减轻电磁脉冲脑损伤中的作用
　　目的：探究异氟醚预处理减轻电磁脉冲脑损伤通过抑制小胶质细胞活化，下调TLR4／NFκB信号通路对大脑皮层发挥保护作用。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组（Control组）和电磁脉冲辐照组（EMP组），异氟醚预处理后电磁脉冲辐照组（EMP+Iso组），单纯异氟醚预处理组（Iso组）。电磁脉冲辐照后时间点根据实验第一部分中TLR4与NFκBp65表达最高的时间点，即辐照后6h选取。采用HE染色方法观察异氟醚预处理后电磁脉冲辐照对大鼠额叶皮层神经元的影响。采用酶联免疫吸附实验方法（ELISA）检测异氟醚预处理后电磁脉冲辐照大鼠大脑额叶皮层促炎因子TNF-α、IL-1β的水平变化。采用蛋白免疫印记法（Western Blotting）检测异氟醚预处理后电磁脉冲辐照对大鼠大脑额叶皮层组织Caspase3、CD11b、TLR4以及NFκBp65蛋白表达水平的影响变化。采用免疫荧光染色观察异氟醚预处理后电磁脉冲辐照对大鼠大脑额叶皮层TLR4以及NFκBp65表达的影响。
　　结果：HE染色结果显示：经 EMP辐照（EMP组）后异常神经元数目较对照组增多（P＜0.05）。EMP+Iso组异常神经元数目较 EMP组减少（P＜0.05）。Iso组大脑额叶皮层异常神经元数目与Control组相比无统计学差异。
　　ELISA结果显示：EMP组组织中TNF-α，IL-β的水平较Control组升高（P＜0.05）。EMP+Iso组组织中TNF-α，IL-β的水平较EMP组减少（P＜0.05）。Iso组大脑额叶皮层TNF-α，IL-β的分泌与Control组相比无统计学差异。
　　Western Blotting结果显示：EMP组组织中Caspase3、CD11b、TLR4、NFκBp65的表达水平较Control组升高（P＜0.05）。EMP+Iso组各蛋白表达水平较EMP组减少（P＜0.05）。Iso组大脑额叶皮层各蛋白表达与Control组相比无统计学差异。
　　免疫荧光染色结果显示：经电磁脉冲辐照后，额叶皮层TLR4与NFκBp65出现大量活化，表达增多，而经异氟醚预处理后，额叶皮层TLR4与NFκBp65的表达减少。Iso组大脑额叶皮层TLR4、NFκBp65的表达与Control组相比无明显差异。
　　结论：异氟醚预处理能够减轻电磁脉冲对大脑皮层神经元的损伤作用，减轻电磁脉冲引起大脑皮层炎性反应及Caspase3的表达，其作用机制有可能是通过下调TLR4／NFκB信号通路，抑制小胶质细胞活化。
　　第四部分、小胶质细胞TLR4/NFκB通路在异氟醚预处理保护电磁脉冲脑损伤中的作用
　　目的：离体研究电磁脉冲对小胶质细胞的影响以及小胶质细胞TLR4/NFκB通路在异氟醚预处理保护电磁脉冲脑损伤中的作用。
　　方法：N9小胶质细胞系传代培养，分为对照组（Control组）、电磁脉冲辐照组（EMP组）、异氟醚预处理电磁脉冲辐照组（ISO+EMP组）和单纯异氟醚预处理组（Iso组）。Western Blotting检测小胶质细胞CD11b，TLR4，NFκBp65的蛋白表达。
　　结果：Western Blotting结果显示：EMP组小胶质细胞CD11b、TLR4、NFκBp65的表达水平较Control组升高（P＜0.05）。EMP+Iso组小胶质细胞各蛋白的表达水平较EMP组减少（P＜0.05）。Iso组小胶质细胞各蛋白的表达与Control组相比无统计学差异。
　　结论：离体实验证明了异氟醚预处理可减轻电磁脉冲引起的小胶质细胞活化，下调TLR4/NFκB信号通路的表达。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1. 电磁辐射

2. 电磁脉冲

3. 小胶质细胞在中枢神经系统中的作用

4. 炎性因子在中枢神经系统中的作用

5. TLR4／NFκB信号在脑损伤中的作用

6. 异氟醚预处理的神经保护作用

第一部分EMP对SD大鼠大脑皮层神经元、促炎因子以及Caspase3的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 EMP对大鼠大脑皮层小胶质细胞与TLR4/NFkB信号通路的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分TLR4／NFκB信号通路在异氟醚预处理减轻电磁脉冲（EMP）脑损伤中的作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第四部分 小胶质细胞TLR4/NFκB通路在异氟醚预处理保护电磁脉冲脑损伤中的作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢