SPIO对两种干细胞生物学特性影响及利用磁靶向技术进行细胞迁移的初探

摘要

背景和目的：龋病和牙周病是临床常见疾病、多发病，往往造成牙髓坏死和牙槽骨吸收以致牙齿缺失。现有的诊疗技术往往无法真正意义上实现牙髓、牙周组织的生理性和功能性再生。因此，在当代口腔医学领域，牙髓和牙周组织再生治疗仍然是学者们研究的热点。随着组织工程技术的不断发展，外源性干细胞植入和自体干细胞归巢疗法在许多组织器官再生的实验研究中已经被广泛开展。然而，由于牙齿解剖结构的特殊性，学者们往往难以将干细胞有效的迁移并富集在牙髓或者牙周组织，同时在进行干细胞治疗过程中也无法对植入的干细胞进行示踪观察，这些都对牙髓和牙周组织原位再生带来了极大的挑战。
　　近年来出现的磁靶向技术可以极大的促进植入的干细胞在靶器官的迁移和定植，同时与之相辅相成的临床MRI检测手段还可以对植入细胞进行无创的示踪观察，这些都为学者进行牙髓和牙周组织再生指明了新的研究方向。在本试验中，我们首先选择了一种新的自带荧光且无需转染剂的 SPIO（MIRB）对人牙髓干细胞进行了标记，探讨了对其活力、增殖、分化等一系列生物学影响，进一步通过MRI技术对裸鼠皮下植入的细胞进行无创示踪观察。接下来我们用SPIO标记了大鼠骨髓间充质干细胞，在体外磁场环境下诱导细胞迁移，同时构建大鼠牙槽骨缺损模型，从静脉注射以及局部注射两种细胞输入途径进行研究，观察体内环境下磁靶向技术在促进干细胞在牙槽骨缺损处的迁移和定植。本实验实现了MRI活体示踪观察植入的干细胞，还丰富了磁靶向技术在牙周组织再生中的运用，为未来牙周再生干细胞疗法提供了新思路。结果如下：
　　第一部分 MIRB标记对hDPSCs的生物学影响以及体内体外MRI成像
　　1.人牙髓干细胞（hDPSCs）培养和鉴定。本研究采用酶消化法/组织块法从成人第三磨牙牙髓组织中分离培养人DPSCs，利用单细胞克隆法纯化细胞，通过体外成骨、成脂诱导分化以及流式细胞仪鉴定确定了其干细胞属性。
　　2. MIRB标记hDPSCs。分别用终浓度为12.5，25，50，100μg Fe/mL的SPIO（MIRB?）标记hDPSCs，利用激光共聚焦、普鲁士蓝染色光镜观察以及透射电镜等手段观察了SPIO纳米颗粒在 hDPSCs细胞内的分布情况，分光光度计测量了各组细胞内铁含量。结果发现， MIRB可以不需要转染剂即可高效的标记hDPSCs，各种浓度标记后对细胞的形态没有影响，且随着标记浓度的升高细胞内铁含量也逐渐上升。
　　3. MIRB对hDPSCs体外生物学特性的影响。采用台盼蓝排斥实验、CCK8实验、流式细胞仪、体内外成骨诱导等手段分别检测了 MIRB标记对 hDPSCs的活力、增殖、干细胞表型、细胞周期、凋亡以及成骨分化的影响。结果发现，12.5-50μg/mL的MIRB标记不影响hDPSCs的活力且可以促进细胞增殖，而100μg/mL则对细胞有毒性，最佳标记浓度为12.5μg/mL；12.5μg/mL的MIRB标记不影响hDPSCs的干细胞表型；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB标记可以加快细胞周期而对细胞凋亡无影响；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB对hDPSCs成骨分化无影响。
　　4. MIRB标记牙髓干细胞的体外、体内MRI成像观察。通过MRI检测手段，体外观察了MIRB标记的hDPSCs细胞团块，体内观察了MIRB标记的细胞膜片在裸鼠皮下的生长情况。体外结果发现，12.5μg/mL的MIRB标记1×105个细胞无法在MRI清晰显影，而用12.5μg/mL-100μg/mL的MIRB标记1×106个细胞均可清晰显影。体内结果发现，MIRB标记的hDPSCs细胞膜片在MRI下可以清晰呈负性对比影像，且随着植入时间延长，无信号影像所占比率也逐渐下降。组织学检查发现，膜片内普鲁士蓝阳性染色细胞数量也随着时间的延长而逐渐下降。
　　第二部分SPIO对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学影响
　　1.大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）培养和鉴定。成功采用全骨髓贴壁法培养了大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）。通过克隆形成实验、干细胞表型测定以及多向分化能力检测确定其干细胞属性。
　　2. Resovist标记rBMMSCs。分别用终浓度为25、50、100μg/mL的SPIO（Resovist）标记rBMMSCs，利用普鲁士蓝染色光镜观察以及透射电镜等手段观察了 Resovist纳米颗粒在 rBMMSCs细胞内的分布情况。结果发现， Resovist同样可以不需要转染剂即可高效的标记rBMMSCs。
　　3. Resovist对rBMMSCs生物学特性的影响。采用台盼蓝排斥实验、CCK8实验、流式细胞仪、体外成骨诱导等手段分别检测了Resovist标记对rBMMSCs的活力、增殖、细胞周期、凋亡以及成骨分化的影响。结果发现，25-50μg/mL的Resovist对rBMMSCs活力没有影响，而100μg/mL对细胞有毒性；25μg/mL不影响细胞增殖、细胞周期以及凋亡，而50-100μg/mL则抑制细胞增殖、减缓细胞周期并促进细胞凋亡，说明25μg/mL的Resovist是标记rBMMSCs的合适浓度；25μg/mL的Resovist对rBMMSCs的成骨分化有促进作用。
　　第三部分 SPIO标记的大鼠骨髓间充质干细胞在体外体内磁场环境下迁移和定植的实验研究
　　1.体外磁场环境下SPIO标记的rBMMSCs迁移实验。利用Transwell小室，在体外磁场环境下观察SPIO标记的rBMMSCs的穿膜能力。结果发现，磁场可以明显促进SPIO标记的细胞穿膜。另外，我们在培养皿底部正中心粘贴磁铁，将SPIO标记的rBMMSCs接种后观察细胞在培养皿内的分布情况，发现细胞围绕磁铁周围呈圆环状分布。
　　2.体内磁场环境下SPIO标记的rBMMSCs向牙槽骨缺损处的磁靶向迁移或定植。构建大鼠牙槽骨缺损模型，分别从静脉途径和局部注射途径输入SPIO标记的干细胞。结果发现，从静脉输入的干细胞大部分被脾脏内巨噬细胞所吞噬，在牙槽骨缺损处未见到远距离迁移的干细胞，而局部注射标记后的干细胞由于有磁场作用可以大量聚集在牙槽骨缺损处。
　　结论：
　　1．第一部分研究结果表明，目前市售的最新的纳米铁颗粒MIRB可以无需添加额外的转染剂即可高效标记人牙髓干细胞；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB标记人牙髓干细胞是安全可靠的；MRI可以对植入体内的hDPSCs细胞膜片进行无创实时观察，是干细胞移植治疗中进行细胞示踪安全有效的手段，为未来利用牙髓干细胞移植进行牙髓原位再生提供了实验依据。
　　2．第二部分研究结果发现，德国Schering的纳米铁颗粒Resovist同样可以无需转染剂即可高效标记大鼠骨髓间充质干细胞；25μg/mL的Resovist不影响大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和活力，50-100μg/mL的Resovist则抑制rBMMSCs增殖、减缓细胞周期并促进细胞凋亡，说明25μg/mL的Resovist是标记rBMMSCs的合适浓度；25μg/mL的Resovist对rBMMSCs的成骨分化有促进作用，其具体机制还需进一步深入探究。
　　3．第三部分研究结果表明，体外磁场环境下可以完美模拟出标记了SPIO的干细胞在磁场作用下发生靶向迁移；体内环境下，构建了牙槽骨缺损的磁靶向诱导细胞归巢实验，结果发现远距离磁靶向诱导 SPIO标记的干细胞归巢至牙槽骨缺损处没有得到理想的预期效果，而磁场促进了局部注射的 SPIO标记的干细胞在牙槽骨缺损处的定植。定植的干细胞是否可以在骨缺损处继续增殖、分化为新的骨细胞并继而参与牙槽骨的重建尚需要进一步更深入的研究去证实。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、牙髓及牙槽骨再生的研究进展

1 细胞移植治疗

2 细胞归巢治疗

二、运用超顺磁氧化铁纳米颗粒进行细胞示踪、磁靶向技术的研究进展

1 磁靶向技术

2 利用超顺磁氧化铁纳米颗粒标记细胞进行细胞示踪

3 磁颗粒技术的其他应用

第一部分 SPIO对人牙髓干细胞的生物学影响及核磁共振示踪观察

实验一 人牙髓干细胞的分离培养与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 MIRB标记人牙髓干细胞

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

实验三 MIRB对牙髓干细胞生物学特性的影响

1 材料

2 方法

3结果

4讨论

实验四 MIRB标记牙髓干细胞的体外体内MRI成像

1 材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分 SPIO对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学影响

实验一 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

1 材料

2方法

3结果

4讨论

实验二 MIRB标记大鼠骨髓间充质干细胞及对其生物学特性的影响

1 材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 SPIO标记的大鼠骨髓间充质干细胞在体外体内磁场环境下迁移和定植的实验研究

实验一 体外磁场环境下SPIO标记的rBMMSCs迁移

1 材料

2方法

3结果

4讨论

实验二 体内磁场环境下SPIO标记的rBMMSCs向牙槽骨缺损处的磁靶向迁移或定植

1 材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢