低温3D打印双相磷酸钙-聚乙烯醇-富血小板纤维蛋白支架的制备及其成骨作用研究

摘要

研究背景：
　　大段骨缺损的修复一直是困扰骨科医生的难题，目前修复策略包括自体骨、异体骨和人工材料移植等。自体骨移植虽是治疗的金标准，但移植过程中会造成取骨区出血、感染；同种异体骨移植存在着免疫排斥、传播疾病的风险；骨组织工程的迅速发展给大段骨缺损的修复提供了一种较为可行的方法。传统方法制备支架的内部结构往往是不可人为控制的，而3D打印技术可针对骨缺损的形状为患者量身定做支架外形；同时，由于制作过程受到电脑的严格操控，可以精细控制支架的孔径、孔道连通率，这对支架发挥功能具有重要的作用。
　　3D打印过程中，生物陶瓷浆料从打印喷头挤出，通过叠层制造的方法堆积成型，浆料中可以加入生物因子或者特定药物，整个打印过程控制在低温下进行，含有生物因子或者药物的浆料通过打印喷头挤出，不破坏生物因子和药物的活性。双相磷酸钙(BCP)是一种生物陶瓷材料，具有优良的生物相容性和生物降解性，目前较多的应用于骨组织工程、骨水泥等的相关研究。聚乙烯醇（PVA）以其良好的生物安全性和力学特性备受研究者青睐。富血小板纤维蛋白（PRF）是第二代血小板浓聚物，制备方法简单，三维网状结构网罗大量血小板激活释放的生物因子，随着纤维蛋白网状结构的降解缓慢释放，促进PRF置入部位的组织愈合。目前，鲜有将以上三种材料混合进行低温3D打印骨组织工程支架的报道。本研究以BCP/PVA/PRF为原料，按照BCP粉末质量/PVA溶液体积/血液体积1：1：1的比例于4℃条件下打印成孔径可控的三维多孔支架，对照组选用传统的注模成型技术制备。本研究通过测定各组支架的表征、体外实验评价支架细胞学作用，体内植入桡骨缺损观察缺损修复的效果，比较不同方法制备支架的促成骨作用。
　　研究目的：
　　1、分别通过3D打印制备BCP/PVA支架、BCP/PVA/PRF支架和使用注模成型法制备非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，比较四组支架理化性质。
　　2、通过对接种于不同支架上的骨髓基质干细胞(BMSCs)的粘附、增殖和成骨分化的进行观察，体外实验比较四组支架的细胞相容性。
　　3、通过兔桡骨临界性骨缺损修复实验，比较四组支架促进骨缺损修复的能力。
　　研究方法：
　　1、3D打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，注模成型法制备非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，利用扫描电镜（SEM）观察打印支架的宏观孔隙结构以及表面微结构；测定接触角、孔隙率、压缩模量和亲水性。
　　2、提取原代兔骨髓基质干细胞，通过流式分析鉴定，鉴定BMSCs纯度，CCK8实验与Annexin V/PI流式分析检测四组不同支架的细胞相容性及毒性，测定四组支架细胞种植效率，免疫荧光染色比较细胞于四组支架的粘附能力。通过CCK8实验测定不同时间点吸光值以及扫描电镜观察不同时间点细胞增殖情况。分别通过测定支架上细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性，qRT-PCR法测定细胞COL-1、ALP、RUNX-2、OPN等成骨相关基因表达量以评价支架诱导细胞定向成骨分化能力。
　　3、将四组不同支架分别植入兔桡骨临界性骨缺损模型。分别于4、8、12周取材，通过Micro-CT扫描三维重建观察新生骨，采用四环素-钙黄绿素荧光双标实验测定矿物沉积率、Van-Gieson染色观察四组支架促进体内成骨的作用。
　　研究结果：
　　1、扫描电镜显示：3D打印支架较注模成型支架具有可控的孔隙结构，支架表面孔径均匀，材料表面粗糙，打印组支架孔隙率高于非打印组（P＜0.05），但伴随孔隙率提高的同时，支架的压缩模量降低；四组支架材料的亲水性能良好，不加PRF的支架接触角为(72±4.82)°，加入PRF的支架接触角为(67±4.49)°（P＜0.05）。
　　2、原代培养BMSCs生长旺盛，流式细胞仪检测CD34-CD44+细胞表面抗原检测结果符合BMSCs特征，CCK8实验与Annexin V/PI流式检测结果发现四组支架无明显的细胞毒性（P＞0.05），而种植效率计算发现打印组支架种植效率低于相应材料的非打印组（P＜0.05），免疫荧光染色检测细胞粘附状态发现打印BCP/PVA/PRF组和非打印BCP/PVA/PRF组支架上细胞粘附状态优于非打印BCP/PVA组和打印BCP/PVA组，细胞种植于支架并培养，3D打印组细胞生长速度最快，生长量最多。细胞种植于支架并培养至7天时扫描电镜结果显示四组细胞均在支架上粘附铺展良好，打印组材料内部孔隙也长满细胞，而非打印组内部没有细胞长入。较之空白对照组，四组支架均促进BMSCs的ALP活性表达，但打印BCP/PVA/PRF组ALP活性最高（P＜0.05），同时打印BCP/PVA/PRF组的成骨相关基因于7天及14天表达量也最高（P＜0.05）。
　　3、Micro-CT三维重建结果显示：在4周、8周和12周，打印BCP/PVA/PRF组支架诱导成骨速度最快，成骨量最多，并且随着新生骨的长入，支架材料缓慢降解，四组支架的骨修复效果明显高于空白对照组（P＜0.05）。荧光双标计算矿物沉积率显示：四组支架矿化速率显著高于空白对照组，打印BCP/PVA/PRF组矿化速率高于打印BCP/PVA组（P＜0.05）。Van-Gieson染色发现4周时染成红色的骨痂包绕着含有PRF的支架，有新生骨组织长入打印支架的孔隙内部；8周时，负载有PRF的支架新生骨组织更多，同时伴随着新生骨的长入，支架材料边缘出现降解；12周时，在负载有PRF的支架周围可见到编织骨及板层骨，并且打印BCP/PVA/PRF组支架大量降解，而其他组板层骨骨质薄且不规则。
　　研究结论：
　　1、运用低温3D打印技术可成功制备BCP/PVA/PRF复合生物支架，打印制备过程可保留PRF中细胞因子活性，使细胞因子从支架中缓慢释放，可控的孔道结构可增加支架孔隙率，但支架的力学强度也随之下降。
　　2、支架材料细胞相容性实验显示无明显细胞毒性，而且 BMSCs在种植支架上粘附良好，并随着时间推移增殖迅速，高连通率的孔隙结构使得BMSCs可以长入支架材料的内部，打印支架可促进BMSCs的成骨分化。
　　3、含有PRF的打印支架可促进体内成骨修复，Micro-CT结果显示打印BCP/PVA/PRF组成骨速度最快，成骨量最多，提示打印BCP/PVA/PRF支架促进骨缺损愈合效果最佳。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1、双相磷酸钙材料研究进展

2、聚乙烯醇组织工程应用进展

3、富血小板纤维蛋白（PRF）应用进展

4、 3D打印技术

第一部分 双相磷酸钙-聚乙烯醇-富血小板纤维蛋白支架的制备及表征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 双相磷酸钙-聚乙烯醇-富血小板纤维蛋白支架的体外生物学评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 双相磷酸钙-聚乙烯醇-富血小板纤维蛋白支架的体内生物学评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢