丝素蛋白/双相磷酸钙仿生多孔人工骨支架制备及异位成骨能力的研究

摘要

本文从以下几部分进行了论述。
　　第一部分 丝素蛋白/双相磷酸钙仿生多孔人工骨支架的制备及相关理化性质分析
　　目的:参照自然骨基质中组成成分的不同,通过改良的气体致孔-相分离法制备模拟自然骨基质的丝素蛋白(Silk Fibroin)/双相磷酸钙(Biphasic Calcium Phosphate)仿生多孔骨支架,并研究不同含量的丝素蛋白对支架孔径,孔隙率,降解率及力学强度的影响,筛选出综合性能最佳的人工骨支架以制备供种子细胞生长扩增的优良载体。
　　方法:前期分别制备SF溶液及羟基磷灰石(HA),β-磷酸三钙(β-TCP)粉体,并按照骨基质中m(HA)/m(β-TCP)=6:4的比例超声混合成双相磷酸钙(BCP),并分析BCP粉体的化学和晶体结构;参照预实验的结果,我们选择7％质量分数的SF溶液作为固化液,按SF溶液与BCP粉体质量比分别为0:100;20:80;40:60;60:40的比例分为四组,充分混合搅拌并加入气体致孔剂,随后放入60℃的水浴锅中充分搅拌直至混合物充满均匀的气泡,调和均匀后将其转移至自制模具中制备人工骨材料,之后通过联合相分离法最终得到常温下固态的仿生多孔人工骨支架,在X线入射偏角为2θ时,行X射线衍射(XRD)分析支架的成分;以SEM及Micro-CT分析孔径及孔隙率,以生物力学测试仪测试四组材料最大抗压强度;将四组材料置于模拟体液(SBF)中,于不同时间点计算其质量变化并取平均值,绘制降解趋势曲线。
　　结果:1:孔径:0％SF组分孔径为(40.43±1.09)μm;20％SF组分:(64.77±1.90)μm;40％SF组分:(150.35±1.21)μm;60％SF组分:(200.93±0.81)μm;其中40％SF,60％SF具备更为适宜细胞生长的孔径。
　　2:孔隙率(％):0％SF为:30.48±1.20;20％SF:63.75±1.22;40％SF:85.67±1.06;60％SF:90.75±1.33,与单纯 BCP材料比较,仿生材料孔隙率更适宜细胞之间的联结(P<0.01)。
　　3:最大抗压强度依次为:(7.57±0.56)MPa;(22.37±0.61)MPa;(40.70±0.39) MPa;(18.75±0.82)MPa;其中40％组分抗压强度显著大于其他三组(P<0.05)。
　　4:观察至第56天时BCP降解率平均仅为28.12％,而SF/BCP仿生材料依次为42.21％,51.81％,60.43％,且SF含量越高,降解越快。
　　结论:四组材料的孔径及孔隙率与SF含量成正比,其中40％SF,60％SF支架具有适宜成骨细胞生长的孔径及孔隙率;含 SF组分的仿生材料抗压强度大于单纯BCP组,并随SF含量的升高呈现先升高后降低的趋势,其中40％SF含量支架的抗压性能明显优于其他三组,与松质骨强度相当;仿生支架的降解率与骨形成率基本一致,利于新生骨组织的替代;综合结果显示含40％SF组分的仿生支架具备更为优良的性能,可以满足组织工程中对支架材料的要求。
　　第二部分 丝素蛋白/双相磷酸钙仿生多孔人工骨支架生物相容性及异位成骨能力的研究
　　目的:将制备的人工骨材料与成骨细胞(MC3T3-E1)共培养,分析其生物相容性;将仿生支架负载MC3T3-E1细胞后植入大鼠下肢肌袋观察其异位成骨能力,为将来脊柱融合及骨缺损实验做前期准备。
　　方法:将成骨细胞(MC3T3-E1)培养于四组不同SF含量的材料浸出液中,以吖啶橙法,MTT法定性定量观测材料的生物相容性;将仿生材料与MC3T3-E1共培养7d后,以电镜(SEM)观察细胞在支架上的生长增殖状况;将SF/BCP负载成骨细胞组,单纯SF/BCP组,成骨细胞组三组分别植入大鼠左下肢肌袋内,通过观测不同时间点影像资料及血液ALP含量评估不同材料的异位成骨能力。
　　结果:与单纯BCP材料相比,仿生材料SF/BCP浸出液对成骨细胞的生长增殖有明显的促进作用;细胞可以顺利攀附在仿生材料上,伸出伪足并分泌基质;结合影像学及生化检测,与单纯SF/BCP组及成骨细胞组相比,SF/BCP负载成骨细胞组具备良好的异位成骨能力。
　　结论:丝素蛋白/双相磷酸钙(SF/BCP)仿生人工骨材料能够高度模拟天然骨基质组成及成骨所需的微环境,可以促进成骨细胞的粘附、增殖,具备良好的生物相容性;单独SF/BCP或成骨细胞暂未发现有异位成骨能力;而SF/BCP仿生材料负载种子细胞(成骨细胞)的形式具有明显的异位成骨能力,在未来脊柱融合及骨缺损治疗方面具有广阔的应用潜力。

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前言

第一部分 丝素蛋白/双相磷酸钙仿生多孔人工骨支架的制备及理化性质分析

材料与方法

1．实验材料与仪器：

2．方法:

3.统计学方法：

结果

1. SF红外光谱表征的观察：

2．电镜下BCP粉体的晶体形态：

2. BCP粉体的FT-IR分析：

4．骨支架形态：

5. XRD表征：

6. 电镜（SEM）下支架的孔径及孔隙率的比较:

8. 骨支架材料的体外降解率:

讨论

结论

第二部分 丝素蛋白/双相磷酸钙仿生多孔人工骨支架生物相容性及异位成骨能力的研究

材料与方法

1 材料与仪器

2 方法

3.统计学方法：

结果

1．MC3T3-E1细胞生长情况:

2．不同组分浸提液对细胞增殖、生长的影响：

3. MC3T3-E1细胞在材料表面的粘附、生长情况：

4. 术后大鼠一般情况观察：

5. 不同时间点三组大鼠左下肢X射线平片及成骨区域灰度值的变化:

6. 术后不同时间点大鼠血液标本中ALP水平的变化:

7. 肌袋组织形态学结果（HE染色）:

讨论

结论

参考文献

综述

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