长链非编码RNA ncRAN-L与肝癌细胞生物学行为的相关性研究

摘要

【背景】： 肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的恶性肿瘤之一。据相关流行病学调查研究报道，全世界2012年的新确诊肝癌患者便已达到78万人，而时至今日这一数字仍在不断攀升。由于其早期诊断困难，确诊时多为晚期，并且初期便极易发生肝内侵袭及转移，患者预后往往不良。目前治疗手段主要依靠于外科手术切除、介入治疗以及以索拉菲尼（Sorafenib）等为代表的小分子靶向药物等。但即便如此，由于肝癌的发生发展机制纷繁复杂，对绝大多数化疗方案并不敏感，小分子靶向药物也因继发性耐药等问题，难以使患者长期获益。肝癌治疗方案的探寻仍任重道远。因此，继续深入研究肝癌致病的分子机制，有利于把握肝癌发展过程中信号通路的关键靶点，开发新型抗癌药物，对进一步改善患者预后具有重要意义。 LncRNAs是近年来发现的广泛存在于基因组中的重要成员。与编码功能蛋白的基因所不同的是，lncRNAs缺乏特异完整的开放阅读框，无法编码蛋白质。正因如此，长久以来其被视作基因组中的“噪音”序列或“暗物质”。但随着研究的深入，目前已有大量研究证实lncRNAs在绝大部分人类肿瘤中存在异常表达，其普遍参与了肿瘤的发生、发展及耐药等重要过程。目前认为，LncRNAs通过多种机制调控基因的转录、转录后及翻译等多个层面，并进而对肿瘤细胞的恶性细胞生物学行为产生影响。而HCC的细胞生物学行为同样受到多种lncRNAs的正向或负向调控。但由于lncRNAs种类众多，调控机制复杂，现有研究关于lncRNAs同HCC间相互作用的研究尚且较少。因此，进一步发掘HCC相关lncRNAs的作用及分子机制，将有助于全面深入的了解HCC细胞复杂生物学行为的调控过程，为临床治疗HCC提供新的筛查及治疗靶点。 【目的】： 在已有研究报道中，选择同其他肿瘤密切相关的lncRNAs予以筛选，初步发现在细胞系及HCC组织中均存在差异表达的lncRNAs分子。研究其与HCC临床病理特征及预后间的相关性。通过建立lncRNAs基因表达下调的模型，研究其在肝癌细胞生物学行为中所发挥的调控作用。并进一步探讨候选lncRNAs分子对肝癌细胞生物学行为的具体分子调控机制，从而完善肝癌细胞生物学行为信号调控网络，为临床提供新的HCC筛查及治疗靶点，为lncRNAs未来应用提供新的实验基础和理论依据。 【方法】： 1.通过文献回顾纳入21种与其他肿瘤密切相关的lncRNAs分子，采用qRT-PCR方法分别检测它们在三种肝癌细胞系与正常永生化肝细胞系中的表达情况，并根据检测结果初步筛选可能与HCC相关的lncRNAs分子；进一步qRT-PCR检测候选lncRNAs分子在47例肝癌组织及相对应的癌旁组织中表达水平予以验证。依据候选lncRNAs分子在肝癌组织中的表达水平高低，划分为高表达及低表达组，分析其表达水平是否与患者临床病理特征及生存预后存在关联。 2.选择HepG2为实验对象，通过小干扰RNA下调lncRNA表达，并选择最佳干扰序列片段，以慢病毒稳转细胞构建lncRNAs稳定下调细胞系。运用MTT法测定对比对照组、阴性对照组及转染组间生长曲线差异，平板克隆形成实验测定各组细胞克隆形成率，EdU法测定各组细胞的DNA复制活性，裸鼠皮下移植瘤实验测定瘤体在体内水平的体积及重量变化，从而评估lncRNAs对肝癌细胞增殖能力影响。划痕实验测定各组细胞侵袭能力，流式Annexin V-FITC法检测各组细胞的凋亡水平，并通过Westernblot蛋白印记方法检测凋亡相关蛋白bax、bcl2的表达变化，从而评估lncRNAs对肝癌细胞侵袭及凋亡行为的影响。 3.通过基因定位信息及生物信息学分析lncRNAs可能的下游靶基因。应用qRT-PCR， Westernblot及免疫组织化学染色的方法检测靶基因在肝癌细胞及正常细胞间，肝癌组织及癌旁组织间在 mRNA及蛋白水平是否存在差异表达，并且分析与lncRNAs表达水平是否存在相关性。在lncRNAs稳定表达下调的HepG2细胞中检测靶基因的表达情况，通过与空白对照组及阴性对照组比较研究靶基因是否受lncRNAs表达调控。设计并构建靶基因过表达载体，转染至lncRNAs稳定下调表达的肝癌细胞中，运用MTT方法、EdU方法、流式Annexin V-FITC方法、West-ernblot蛋白印记方法检测 lncRNAs是否通过靶基因对肝癌细胞的增殖及凋亡能力发挥作用。 4.根据生物信息学推测lncRNAs及靶基因信号下游可能参与的肝癌异常信号通路，在 lncRNAs干扰以及靶基因过表达的细胞系中检测该信号通路关键蛋白的活化表达水平。并运用该信号通路的激动剂及特异抑制剂来分析lncRNAs及靶基因对于肝癌细胞生物学行为调控是否通过该信号通路发挥其生物学功能。 【结果】： 1.通过对21种lncRNAs在肝癌细胞系及正常永生化肝细胞系中差异表达的分析，发现未能在细胞中检测到基因表达的（共4种）、表达丰度过低的（Ct值>35，共9种）或是在肝癌细胞系与正常永生化肝细胞系中无表达差异的lncRNA分子（共6种）。初步获得ncRAN-L及UCA1两个候选lncRNA分子。我们选择ncRAN-L作为本课题的研究对象，检测组织样本后发现，其在肝癌组织与相对应的癌旁组织中同样存在差异表达。此外，高表达 ncRAN-L组患者的肿瘤体积（χ2=8.563, P=0.003）以及瘤体数目（χ2=6.940, P=0.008）均显著高于低表达组，而同性别、年龄、AFP水平、是否发生淋巴结转移、远隔转移不相关。Kaplan Meier生存分析结果显示低表达 ncRAN-L组患者具有比高表达组更佳的生存时间优势（Log-rankχ2=4.439，P=0.0351）。Cox多因素分析结果显示，ncRAN-L表达水平是肝癌患者预后的独立预测因子，HR=2.347（95%CI,1.091-5.048），P=0.029。 2.通过小干扰RNA瞬转HepG2后检测表达情况，我们选择si-RA1作为后续实验的干扰序列片段。慢病毒包装si-RA1后稳转HepG2细胞后，成功构建ncRAN-L稳定表达下调的HepG2/si-RA1细胞。MTT实验结果显示：肝癌细胞中ncRAN-L的表达下调能够显著抑制其增殖能力；平板克隆实验结果显示：ncRAN-L表达下调能够抑制肝癌细胞的克隆形成能力；EdU实验结果显示：ncRAN-L表达下调能够抑制肿瘤细胞的DNA复制活性；裸鼠皮下移植瘤实验结果显示：si-RA1干扰组对比阴性对照组，其瘤体的生长曲线明显低于后者。而通过测量处死裸鼠后剥离的瘤体，我们发现si-RA1干扰组的瘤体重量亦显著低于阴性对照组。划痕实验结果显示：si-RA1组的细胞与两个对照组间比较无显著差异。流式Annexin V-FITC结果显示：si-RA1组细胞发生凋亡的比率（24.22%±2.10）均显著高于其他两组（vs. si-NC,7.72%±1.15; vs. control5.42%±0.68），凋亡蛋白bax、bcl2的表达水平检测结果支持这一观点。 3.根据基因定位及生物信息学分析，我们发现 ST6GALNAC2位于 ncRAN-L下游4.3kb位置处，并与乳腺癌及甲状腺癌细胞生物学行为相关，初步推测其有可能是 ncRAN-L的下游靶基因。qRT-PCR、免疫组织化学、Westernblot法发现ST6GALNAC2的mRNA及蛋白在肝癌细胞与正常永生化细胞系间，肝癌组织和癌旁组织间均存在显著差异。统计学分析显示，在组织中ST6GALNAC2的表达同 ncRAN-L呈正相关（r=0.3674，P=0.0111）。此外，在 HepG2/si-RA1细胞中ST6GALNAC2的表达显著降低，提示其可能受到ncRAN-L的调控。MTT实验、EdU实验、流式Annexin V-FITC、Westernblot法结果显示：在HepG2/si-RA1中上调 ST6GALNAC2的表达能够一定程度逆转由于 ncRAN-L被敲除后所导致的细胞增殖能力减弱，增强细胞DNA复制活性，并恢复HepG2细胞对于凋亡的耐受能力。 4. Westernblot蛋白印记检测 HepG2/si-RA1细胞及过表达 ST6GALNAC2的HepG2/si-RA1细胞中PI3K/Akt核心蛋白Akt及具有活性的磷酸化p-akt后发现，下调 ncRAN-L的表达能够显著抑制 p-akt的表达水平，而在此基础上过表达ST6GALNAC2则能够一定程度提高磷酸化 p-akt。这初步提示我们 ncRAN-L/ST6GALNAC2可能参与了肝癌细胞异常的PI3K/Akt信号通路中。为进一步确认ncRAN-L的功能，我们将PI3K/Akt激活剂Igf-1及特异抑制剂LY294002分别与HepG2/si-RA1细胞及过表达ST6GALNAC2的HepG2/si-RA1细胞相互作用，结果发现激活剂Igf-1能够恢复HepG2/si-RA1细胞因ncRAN-L被敲除后所导致的增殖能力下降，并恢复对细胞凋亡的耐受；而特异抑制剂LY294002则能够抑制因过表达 ST6GALNAC2后 HepG2/si-RA1所恢复的细胞增殖能力，并拮抗其对细胞凋亡的耐受行为。这说明PI3K/Akt信号通路可能是ncRAN-L调控肿瘤细胞增殖及凋亡的可能机制之一。 【结论】： 1.我们发现了lncRNA ncRAN-L在肝癌细胞及肝癌组织中高表达，并且其表达水平与肝癌患者临床病理特征以及生存预后均具有相关性，提示其可能在肝癌发生发展中发挥癌基因的作用，并有望作为肝癌患者临床预后评估的独立预测因子。 2. ncRAN-L能够通过上调肝癌细胞增殖能力、调控bcl2/bax通路抑制细胞凋亡来发挥对肝癌细胞恶性生物学行为的调控作用，但对肝癌细胞的侵袭能力无影响。 3. ST6GALNAC2是ncRAN-L的靶基因之一，ncRAN-L通过上调ST6GALNAC2表达水平来使肝癌细胞下游的 PI3K/Akt信号通路活化，从而调节肝癌细胞增殖及凋亡等恶性生物学行为。这阐述了lncRNAs同肝癌细胞生物学行为间的新机制，为临床寻找治疗肝癌新靶点提供了理论基础及实验依据。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、肝癌研究进展回顾

二、LncRNAs研究进展回顾

三、 展望

第一部分 LncRNA ncRAN-L在肝癌中表达及相关意义

引言

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4 讨论

第二部分LncRNAs ncRAN-L对肝癌细胞生物学行为的影响

引言

1. 材料

2. 方法

3 结果

4 讨论

第三部分LncRNA ncRAN-L调控肝癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究

引言

1. 材料

2. 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢