卵寄生真菌虫草棒束孢几丁质酶基因IFCHI1克隆与生物信息分析

摘要

根结线虫病是一种在全球范围内均有发生的危害性相当严重的植物寄生线虫病害。而常用的化学杀线剂不但污染环境，且对人畜有害，同时大量使用化学类产品使根结线虫的抗药性不断增强，药剂防治效果降低，并且许多杀线剂如溴甲烷等已被禁止在农作物种植生产方面使用。对环境友好的可持续治理—生物防治正在逐渐发展成为植物根结线虫防治方案中的主导方法。
　　利用根结线虫的天敌微生物（如真菌等）进行根结线虫病害防治，是目前生物防治方法中的主要手段，本研究通过利用形态学及分子生物学方法对菌株HNE3分析鉴定，结果显示分离自河南三门峡渑池县烟草根结线虫卵上的真菌 HNE3为虫草棒束孢I.farinosa。该菌在几丁质酶诱导培养条件下表现了较高的产酶活性，并第6d达到产酶高峰（19.3U/mL）。通过 WA培养基进行卵寄生实验，发现在接种6d后的寄生率高达81.3％。利用几丁质酶培养滤液处理根结线虫的卵，在第7d对其孵化抑制率可达84.11%。
　　为研究卵寄生真菌 HNE3在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用，本研究采用RT-PCR及RACE技术，首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1417bp，具有1个内含子，长度为61bp，包含1个1185bp的开放阅读框（ORF），编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析，该蛋白理论分子量为44.1kD，等电点为4.88。通过GenBank比对，几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶，比对分析不同来源真菌几丁质酶，发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和DFDGXDIDWE及结合区保守序列GXWEXGXXDYK和GLGGXMWWE。同源性比对发现，该几丁质酶同昆虫寄生真菌几丁质酶同源关系近。通过酶学活性分析，该菌热稳定性及耐酸碱稳定性，且加入金属离子（如Mg2+等）能够显著增加酶活。
　　本研究为进一步明确该菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵壳降解及降低孵化率的作用机理提供理论依据。

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第一章 文献综述

1 根结线虫的危害和习性

2 根结线虫病害的防治策略

3真菌生防因子的研究

4 几丁质和几丁质酶

5 几丁质酶对根结线虫卵的影响

6 虫草棒束孢Isaria farinosa的研究进展

第二章 卵寄生真菌虫草棒束孢HNE3的分离与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第三章 虫草棒束孢HNE3及其几丁质粗酶液对南方根结线虫卵的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第四章 卵寄生真菌虫草棒束孢几丁质酶基因IFCHI1的克隆与分析

1 材料与方法

2 结果

3 结论

第五章 几丁质酶酶学活性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第六章 讨论与展望

1 讨论

2 展望

参考文献

致谢

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