弹涂鱼免疫球蛋白重链基因分析

摘要

免疫球蛋白是B细胞在对抗原刺激的免疫应答中产生的一类糖蛋白，由两条重链和两条轻链组成，并分为可变区和恒定区。研究不同物种免疫球蛋白基因的种类和结构是了解其起源与进化的重要依据。弹涂鱼属硬骨鱼类、鲈形目，有鳃，但在保持身体湿润之时，长时间暴露在空气中而不会死亡，呈现两栖类动物的特点。研究弹涂鱼免疫球蛋白的基因，可以进一步了解鱼类向两栖类进化过程中的免疫球蛋白信息，并可以加深对动物免疫球蛋白基因进化关系的了解。
　　通过对弹涂鱼总RNA进行转录组测序并分析，得到52404条序列，从注释中搜索得到26条与免疫球蛋白相关的序列：其中有4条免疫球蛋白重链基因序列，3条免疫球蛋白轻链基因序列。应用Local-BLAST程序，以斑马鱼免疫球蛋白序列作为参照，进行比对搜索，我们共得到8条免疫球蛋白重链序列，7条免疫球蛋白轻链序列。
　　利用5’RACE扩增试验，构建了弹涂鱼免疫球蛋白可变区的文库，并分别对VH、JH以及CDR3进行了统计分析。VH进行了基因家族分析，按照同一个VH片段家族核苷酸序列75％相似性的标准，一共有8个VH家族，以C39.seq为代表的家族（VH I家族）出现频率最高，F45.seq为代表的家族则最低；我们筛选到了使用频率较高的3个JH序列，JH1、JH3和JH5，它们都具有与哺乳动物相近的保守氨基酸序列；所有可变区CDR3的长度为4-14 AA，平均9.78±3.15 AA。
　　利用保守的JH基因片段，设计3’RACE引物，最终我们发现了两种重链免疫球蛋白类型：IgM、IgD。IgM编码区有1341 bp，编码447个氨基酸，与鳜鱼的氨基酸序列相似性最高，为44%；IgD编码区有2601 bp，氨基酸序列同源性比对同样与鳜鱼为最高，序列分析显示IgD重链应用了Cμ1作为第一个结构域，这可能与IgD第一结构域缺失，而利用Cμ1保守的半胱氨酸与轻链相互作用形成二硫键有关。
　　通过定量PCR检测了IgM在组织中的表达情况。组织表达显示，免疫球蛋白基因在不同组织中的表达有一定的偏好性，IgM在脾脏中表达量最高，其他组织中仅有少量表达。

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1 文献综述

1.1 免疫球蛋白的分子结构

1.2 免疫球蛋白多样性的分子机制

1.3 硬骨鱼类免疫球蛋白重链基因

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 技术路线

2.2 实验材料及试剂的配置

2.3 主要实验仪器

2.4 实验方法

2.5 DNA测序

2.6 5’RACE实验方法

2.7 3’RACE实验方法

2.8 引物合成

2.9 数据处理及格式转换

2.10 主要数据库及分析软件

3 结果与分析

3.1 转录组数据综述

3.2 免疫球蛋白重链V区文库构建与筛选

3.3 免疫球蛋白重链恒定区克隆与分析

3.4 重链恒定区基因的组织表达

3.5 讨论

4 结论

参考文献

附录A

附录B

致谢

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