基于海藻酸牺牲材料构建微脉管系统及其用于肝组织工程的研究

摘要

随着组织工程技术的发展，利用肝细胞和生物材料体外构建类肝组织体为肝脏疾病的治疗带来了希望。但是，在目前肝组织工程的研究中，仍然存在着两个主要问题，一个是肝细胞体外培养中的极性丢失问题，另一个是物质传递限制导致的细胞坏死问题。本研究根据肝窦的结构特征，以肝实质细胞、血管内皮细胞和凝胶基质材料为基本元素，构建一个体外类肝组织体，探索解决肝组织工程领域的核心问题。具体来说，我们以海藻酸凝胶作为牺牲材料，通过对其进行微加工成型、表面修饰、包埋、去凝胶化等过程操作，构建一个基于凝胶基质的微流控通道系统。在微流控通道内种植人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs），经过三维培养，形成一个近似于体内血管壁的内皮细胞层。在此基础上，将肝实质细胞装载到外围凝胶基质中，形成一个结构有序的共培养体系，研究该体系对物质传递和肝细胞功能的影响。具体研究内容如下： （1）构建一个基于海藻酸牺牲材料的微通道体系。首先通过流体纺丝法制备海藻酸微型柱状凝胶，考察二价阳离子、针头内径和流体流速对海藻酸凝胶形貌及力学性能的影响规律。研究发现，使用Ca2+作为交联因子，流体流速范围控制在60-180 μL/s的范围，所制备的柱状凝胶直径与打印针头内径成正相关。然后将该微型柱状凝胶包埋在外围基质中，考察外围基质的组分对其力学稳定性及生物性能的影响。最后，以柠檬酸钠溶液作为液化剂，将包埋于外围基质体系中的海藻酸凝胶液化后形成微通道。通过考察体系中微通道的结构及性能，筛选出一个快速有效且生物相容的去凝胶化方法。 （2）微脉管系统的构建。首先使用壳聚糖（CS）修饰海藻酸钙凝胶，在其表面形成一层复合膜结构。考察了壳聚糖与海藻酸钙凝胶反应时间对复合膜结构及生物性能的影响。反应时间为3-7 min时，可形成5 μm-15 μm厚度的壳聚糖膜。在修饰后的海藻酸钙凝胶表面接种HUVECs，培养9天后，形成致密细胞层。经细胞增殖、凋亡分析，具有复合膜的海藻酸钙凝胶（CS/Ca-Alg）可促进细胞增殖，抑制细胞的凋亡。之后将铺满内皮细胞的CS/Ca-Alg 包埋于三维复合凝胶中，使用柠檬酸钠溶液溶解并形成微脉管结构。考察柠檬酸钠溶液浓度对凝胶完全液化时间及细胞活性的影响，结果显示15 mM的柠檬酸钠可在20-40 min内将直径为500-1000 μm的海藻酸钙凝胶完全液化，且可保持细胞活性在80%以上。最后，我们分别对通道内物质的传递做了评价，发现具有膜结构的微流控通道及脉管系统都可以选择性的透过分子。 （3）体外构建具有脉管系统的类肝组织体。在上述研究工作的基础上，以人肝癌细胞系（HepG2）为模型，利用该脉管系统组建了一个结构有序的共培养体系。一方面，该脉管系统作为营养物质的传输系统，为三维体系中的肝细胞代谢提供足够的营养物质，因此解决了仅依靠扩散效应而形成的物质传递限制问题。另一方面，该脉管系统作为有序共培养体系的架构，为肝细胞极性重建和功能修复提供了一个微环境。研究发现，包埋在脉管系统中的肝细胞活性显著增强，肝细胞特定功能的表达，包括白蛋白的分泌以及肝细胞特定基因的表达水平得到了显著改善。与异物代谢相关的基因CYP1A1 、CYP3A4、UGT1A1与 GSTA1表达水平分别增加了3.5倍、11.1倍、7.9倍、5.6倍。与合成相关的转录因子NDUFA3与GCLM分别增加了2.0、4.2倍。培养5天后，在脉管系统中内皮细胞的影响下，肝细胞白蛋白的分泌量增加了2.8倍。 综上所述，本研究提出一种构建微通道和微脉管系统的方法，该脉管结构作为物质传递系统能够为组织体中的细胞提供丰富的营养物质。更重要的是，它可作为一个有序的共培养体系，为肝细胞极性重建和功能修复提供了一个良好的微环境，为探索肝组织工程的研究提供一个新思路。

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