油菜花叶病毒(ORMV)126kDa复制酶基因在拟南芥中的可诱导表达

摘要

植物病毒危害农作物的形势十分严重，是导致植物病害的主要原因之一。植物病毒对农作物的危害不仅严重威胁农业生产结构，对农业经济也造成了严重损失。因此，如何防治植物病毒病害早已是科学家们所需要研究和解决的重要课题。随着研究发现，植物本身具有能够抵抗植物病毒的防御机制，即RNA干扰机制。RNA干扰是由双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象。植物体内的小RNA在植物对抗病毒的RNA干扰机制中起着核心作用，它来自于非蛋白编码RNA的前体。小RNA通过碱基互补配对原则与靶mRNA结合起负调控的作用，利用sRNA抗植物病毒是近年来所研究的一种有效手段。但是病毒为了有效侵染植物，就必须抑制植物体内RNAi机制。因此，植物病毒同时也能够编码蛋白在RNAi的不同步骤起到抑制作用，这类蛋白被称为基因沉默抑制因子。油菜花叶病毒ORMV作为危害油菜等作物生产的病毒之一，属于烟草花叶病毒属。ORMV基因结构中的复制酶基因表达的126kDa蛋白是一种基因沉默抑制因子。126kDa复制酶蛋白在体外（in vitro）可结合21nt左右的小RNA，油菜花叶病毒的侵染不仅能引起21nt小RNA的积累，还对该类小RNA的底物mRNA的表达产生了影响。
　　本研究利用植物的可诱导表达技术，在拟南芥中有条件地表达126kDa复制酶蛋白，进而研究ORMV126kDa复制酶蛋白对植物内源小RNA代谢与功能的影响。这些内源小RNA与植物对病毒侵染的应答有着紧密联系，所以研究这些富集的小RNA类别及作用机制也有助于抗病育种的进一步发展。Silwet-L77是一种非离子型的表面活性剂，常用于植物的转化。本研究发现，Silwet-L77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率。同时，我们比较了不同培养温度、不同培养浓度（OD600值）及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响。我们发现，28℃培养E.coli至OD600值为0.55-0.6之间时制备感受态细胞，利用9％的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞，转化时加入15~20ppm的Silwet-L77，可以获得最高的转化效率。总之，进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备方法以及转化方法。

目录

前言

第一章 绪论

1.1 基因沉默

1.2 诱导表达体系

1.3本研究的目的及意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 激活元件的构建

2.4 应答元件的构建

2.5 大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法

第三章 诱导表达126kDa复制酶蛋白的结果与分析

3.1 激活元件的构建

3.2 应答元件的构建

3.2 获得激活元件的抗性植株

3.3 获得应答元件的抗性植株

3.4 转基因植株的PCR检测鉴定

3.5 过量表达复制酶蛋白影响植物的发育

第四章 优化大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法的结果与分析

4.1 不同培养温度对感受态细胞转化效率的影响

4.2 不同培养浓度对感受态细胞转化率的影响

4.3 PEG4000对感受态细胞转化效率的影响

4.4 表面活性剂对感受态细胞转化效率的影响

4.5 冷冻保护剂甘油和DMSO的适宜浓度

4.6 PEG4000和Silwet L-77共同作用对质粒转化大肠杆菌效率的影响

4.7 优化后的高效感受态细胞的制备和转化方法

第五章 讨论和结论

5.1 关于ORMV 126kDa复制酶基因在拟南芥中诱导表达的讨论和结论

5.2 关于优化大肠杆菌感受态制备与转化的讨论和结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学士论文