二-（4-氯苯甲酰异羟肟酸）二正丁基合锡（DBDCT）的药代动力学和抗癌作用机制研究

摘要

目的：合成抗癌化合物二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡(DBDCT)，制备注射剂和脂质体两种制剂，建立其质量标准，进行体外和体内抗肿瘤活性测定，研究大鼠尾静脉注射DBDCT后的药代动力学，并通过体外肿瘤细胞培养研究其引起肿瘤细胞毒的作用机制。 方法：(1)合成2种有机锡化合物，并通过红外光谱(IR)、核磁共振氢谱(1HNMR)、碳谱(13CNMR)、锡谱(119SnNMR)、质谱(MS)以及X-射线单晶衍射(X-Ray)进行结构表征。选择体外活性较强的化合物2(DBDCT)作为研究对象，制备其注射剂和脂质体两种制剂，并建立两种剂型的质量标准。(2)通过Bliss法测定小鼠静脉注射DBDCT后的半数致死量(LD50)，为体内抗肿瘤药效学和药代动力学研究给药剂量提供依据。(3)以肿瘤移植小鼠为模型，以顺铂(DDP)为阳性对照，研究静脉注射低、中、高三个剂量DBDCT后S180、H22和EAC小鼠体内的抗癌活性，同时考察实验小鼠外周血白血球数目、免疫器官胸腺和脾脏重量和指数、脏器重量和系数以及血液主要生化指标等，初步判断药物作用的毒性靶器官，采用G-CSFELISE试验，检测DBDCT是否引起造模小鼠的炎症。(4)通过HPLC和UPLC-MS技术，研究大鼠尾静脉单剂量注射高、中、低三种剂量DBDCT注射液后原药及其主要代谢物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程，通过平衡透析法测定DBDCT与大鼠血浆蛋白结合率。(5)DBDCT作用后，采用MTT法测定体外培养的细胞株的增殖抑制率，并以SGC-7901为代表，采用流式细胞术(FCM)研究DBDCT对SGC-7901细胞增殖指数和细胞周期影响。(6)采用分光光度法测定DBDCT对SGC-7901癌细胞作用前后Caspase-3、Caspasc-8和Caspasc-9活性的变化；用Caspasc-8抑制剂阻断DBDCT诱导SGC-7901细胞的Caspase-8途径产生的凋亡；采用新型荧光染料Flou3-AM检测Ca2+水平，以罗丹明123测定线粒体跨膜电位(△ψm)变化，同时检测作为第二信使的活性氧(ROS)的表达，并通过Westernblot分析Caspase-3、Cyt-C、Bax和Bcl-2等蛋白表达，进一步证实Caspases凋亡信号转导通路。 结果：(1)得到了2种新的有机锡化合物，分别为：[(n-Bu)2Sn(C7H5NO2Cl)Cl]和[(n-Bu)2Sn(C7H5NO2Cl)2](DBDCT)。制备了DBDCT注射剂(7.5mg/5ml)和脂质体(10mg/10ml)两种剂型，并建立了质量标准，注射剂质量标准包括性状、鉴别、检查(pH值、装量、有关物质和无菌、热源)、含量测定等；脂质体包括形态、粒径、包封率、突释效应和有机溶剂检查、含量测定等，为后续动物试验质量控制提供了保障：(2)急性毒性试验表明静脉注射DBDCT后的半数致死量LD50=21.1mg/kg，LD50(Feiller校正)95％的可信限为17.4～25.5mg/kg，LD50的标准误为0.01；(3)体内抗肿瘤药效学实验中，DBDCT注射液组对S180和H22的生长显示了不同的抑制作用，中剂量和高剂量组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05和P＜0.01)。体内抗肿瘤活性显示出良好的剂量依赖性。采用G-CSFELISE试验，以角叉菜胶为急性非特异性炎症模型。试验中S180、H22和EAC小鼠的胸腺指数和脾脏指数随着DBDCT剂量的增大而降低，DBDCT可能会抑制胸腺和脾脏的发育。高剂量组DBDCT可能对肝、睾丸、胸腺、脾和卵巢有损伤。(4)大鼠尾静脉单剂量注射2、5和12mg/kg三种剂量注射液后，能迅速被分布或消除，三种剂量下分布半衰期(T1/2,α)很短，分别为2.3585、1.9614和2.1146min消除半衰期(t1/2,β)为64.67、56.80和220.60min。以5mg/kg的给药剂量为例对比考察了脂质体在大鼠体内的动力学参数，脂质体血药浓度可维持12h以上，药时曲线下面积AUC是相同剂量注射液的7倍以上，消除半衰期(t1/2β)为相同剂量注射液的12倍，清除率CL(s)比相同剂量注射液减小8倍左右，延长了DBDCT在体循环系统中的滞留时间。DBDCT在血浆、尿液和胆汁中均不稳定，逐渐脱掉配体、烷基和氯等基团而代谢转化，可能主要经肝微粒体酶脱烷基而代谢转化后大部分经肾或胆汁排出。(5)MTT细胞存活率试验显示，DBDCT能抑制白血病细胞HL60、宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞T24以及胃腺癌细胞SGC-7901等细胞株的生长，作用效果具有一定的量效关系。DBDCT对SGC-7901作用不同时间(12h,24h,48,72h)后IC50分别为：81.6、25.3、4.5、2.8nmol·L-1。随着DBDCT浓度和作用时间的延长，实验组p21、p53和BaxmRNA表达明显高于空白对照组(P＜0.05和P＜0.01)，Bcl-2和Bel-2/Bax的表达明显低于空白对照组(P＜0.001)。(6)不同浓度DBDCT对SGC-7901作用不同时间后caspase-3、caspase-8和caspase-9酶的活性显著增加(P＜0.05和P＜0.01)，证实了DBDCT诱导SGC-7901细胞凋亡与线粒体和死亡受体途径有关。采用caspase-8抑制剂不能抑制DBDCT诱导SGC-7901细胞的凋亡，确证DBDCT可通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡。Flou3-AM检测，细胞内Ca2+浓度显著升高。罗丹明123测定，线粒体跨膜电位显著降低或消失，与DBDCT作用剂量和时间呈负相关。DBDCT迅速引起SGC-7901细胞内ROS的增加，提示DBDCT作用于细胞后可刺激肿瘤细胞ROS的产生。通过Westernblot分析Caspase-3、CytC、Bax和Bcl-2等蛋白表达，随着DBDCT的浓度和作用时间增加，实验组Bcl-2蛋白表达下凋，而Bax、CytC和Caspase3等蛋白表达上调，且有明显量效和时效关系，Bcl-2/Bax蛋白比值从1-30下降至0.52，与RT-PCR的结果一致，初步证实了Caspases凋亡信号转导通路。 结论：(1)DBDCT注射剂和脂质体的质量标准符合要求，为后续动物试验的质量控制提供保障。(2)静脉注射DBDCT后对S180、H22和EAC小鼠具有较高的体内抗癌活性，主要的毒性靶器官可能是肝、睾丸、胸腺、脾和卵巢等，G-CSFELISE试验检测DBDCT不会引起小鼠的炎症反应，可能具有提升白细胞的功能。(3)采用HPLC和UPLC-MS技术基本阐明了大鼠尾静脉注射DBDCT后在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄以及血浆蛋白结合率等，探讨了化合物发挥药效和毒性作用的化学物质基础。(4)确证了DBDCT能够诱导体外培养的SGC-7901肿瘤细胞发生凋亡，作用机制之一可能是通过p53信号传导通路：即p53激活Bax基因，抑制Bcl-2基因表达，通过破坏Bax与Bcl-2之间的平衡来完成p53介导的细胞凋亡信号转导机制。(5)DBDCT诱导SGC-7901细胞凋亡与线粒体途径、死亡受体途径有关。重点探讨了线粒体途径Caspases凋亡信号转导通路，即Caspase-8作为凋亡反应的上游调控蛋白，其活化将激活Caspase-9，Caspase-9又激活Caspase-3，细胞内游离Ca2+是激活Caspase-3的先决条件之一，Ca2+稳态的破坏可直接引起线粒体释放细胞色素C和一些促细胞凋亡因子。同时DBDCT诱导线粒体活性氧ROS的增加，引发Bcl-2下调和Bax上调，自由基的不断攻击引起线粒膜电位△ψm下降，通透性增加，Cyt-C从线粒体释放后，与凋亡酶启动子结合，在脱氧三磷酸腺苷存在下激活Apaf-1。活化的Apaf-1会结合procaspase-9而启动一系列的Caspases级联反应，激活典型的线粒体凋亡通路。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明:英文缩略词表

声明

第一章DBDCT的合成、制剂和动物药用质量标准研究

引言

一、DBDCT的合成与结构

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

二、制剂和动物药用质量标准研究

(一)注射剂的制备

(二)脂质体的制备

(三)讨论

三、本章小结

第二章DBDCT注射液在小鼠体内主要药效学研究

引言

一、急性毒性实验

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

二、DBDCT注射液在小鼠体内抗肿瘤的主要药效学研究

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

三、G-CSF ELISE试验验证DBDCT是否引起“升白”药理作用

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

四、本章小结

第三章DBDCT注射液在大鼠体内药物动力学和代谢研究

引言

一、DBDCT注射液的吸收动力学研究

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

二、DBDCT注射液的在大鼠体内的组织分布和排泄

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

三、DBDCT注射液与大鼠血浆蛋白的结合率实验

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

四、DBDCT注射液在大鼠体内代谢产物的鉴定

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

五、本章小结

第四章DBDCT对体外培养肿瘤细胞的作用机制研究

引言

一、DBDCT诱导肿瘤细胞周期阻滞及凋亡的研究

1材料

2实验方法

3结果与结论

4讨论

二、DBDCT在肿瘤细胞凋亡信号传导通路中的作用及影响

1材料

2实验方法

3结果和结论

4讨论

三、本章小结

主要结论

参考文献

综述

个人简历

致谢