增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌样细胞研究

摘要

目的: 探讨增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)转染骨髓间充质干细胞的可行性，明确经蛋白标记后的间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是否可以稳定生长并被诱导成为心肌细胞以及心肌微环境对转染MSC在体外向心肌样细胞分化的影响，为进一步做标记的MSC体内移植研究奠定基础。 方法: 1、提取、鉴定pEGFP质粒； 2、大鼠骨髓间充质干细胞的的分离和培养； 3、新生乳鼠心肌细胞的分离和培养； 4、制备心肌细胞裂解液； 5、EGFP基因转染骨髓间充质干细胞； 6、筛选阳性转染细胞后在荧光显微镜观察，然后对比建系，并体外诱导其向心肌样细胞转化； 7、把诱导的细胞做免疫组化检测心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、α—肌动蛋白、连接蛋白43及CD31的表达情况，通过计算机分析系统测定其阳性率。 结果: 原代MSC多呈纺锤形或梭形，有聚集生长的倾向，3～5个细胞成为一个集落。传代后，细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大；在脂质体介导下将EGFP基因导入MSC，在荧光显微镜下观察，细胞的生长和增殖不受影响。增强型绿色荧光蛋白在基因转染12h后开始表达，48～72h达高峰。在1周内有较强的表达。1周后表达绿色荧光的细胞逐渐减少，到4周时仍可见少量散在的荧光。瞬时转染率达20％～30％。质粒和脂质体的浓度比例在1：2到1：3转染效率最高。 结论: 绿色荧光蛋白可成功转染骨髓间充质干细胞；转染效率与脂质体和质粒浓度有关；转染后骨髓间充质干细胞生长良好，在体外可以成功诱导成为心肌样细胞。

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综述 绿色荧光蛋白在干细胞研究中的应用进展

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