来氟米特抑制高糖环境下smad通路所致的足细胞凋亡及其机制研究

摘要

研究背景：
　　 糖尿病肾病是糖尿病最常见、最严重的慢性并发症之一。尽管糖尿病肾病的发病机制尚未完全清楚，但大量研究证明，足细胞的损伤与糖尿病肾病的形成与发展密切相关。
　　 TGF-α/smad信号通路在糖尿病肾病的发病中具有重要作用，研究表明：高糖环境下可以激活TGF-α系统，经smads蛋白发生磷酸化介导TGF-α信号由细胞膜进入细胞核，诱导足细胞凋亡，促进肾小球硬化。来氟米特作为一种新型免疫抑制剂，近年来广泛应用于肾脏病的治疗。有研究报道，在体外培养的肾小球系膜细胞，来氟米特能部分阻断TGF-α/Smad信号传导通路的激活，而在人肾小球足细胞来氟米特是否可通过该通路发挥作用尚未有过进一步研究，本实验即通过高糖刺激下足细胞凋亡与smad通路的关系来研究来氟米特是否可以通过抑制smad信号转导途径从而抑制足细胞凋亡，为糖尿病肾病的治疗提供更多的理论和实验依据。
　　 方法：
　　 1.传代培养人肾小球足细胞后根据不同的实验目的进行分组：⑴正常糖对照组：D-葡萄糖10mmol/L；⑵高渗对照组：20mmol/L 甘露醇+D-葡萄糖10mmol/L；⑶高糖刺激组：D-葡萄糖30mmol/L；⑷来氟米特干预组：终浓度为20μmol/L的来氟米特+D-葡萄糖30mmol/L；
　　 ⑸抑制剂Staurosporine组：终浓度为5umol/L的Staurosporine+D-葡萄糖30mmol/L。
　　 所有实验用足细胞均在5-10代。
　　 2.用western blotting 法检测各组smad2/3蛋白及p-smad2/3蛋白的表达，并用流式细胞仪检测不同时间点足细胞的凋亡。
　　 3.观察高糖环境下p-smad2/3蛋白的表达及足细胞的凋亡率，并观察p-smad2/3 特异性抑制剂Staurosporine及来氟米特活性代谢产物A771726对高糖环境下p-smad2/3蛋白表达及足细胞凋亡的影响。
　　 结果：
　　 ⑴各组之间总smad2/3蛋白表达无明显差异。正常糖及高渗对照组足细胞仅有微量p-smad2/3蛋白表达，高糖刺激组足细胞于24h时smad2/3蛋白发生磷酸化，开始激活，72h 达高峰，72h后蛋白表达开始下降。在高糖刺激72h蛋白表达的高峰点时，来氟米特组及p-smad2/3 特异性抑制剂Staurosporine组p-smad2/3的表达明显抑制，其中来氟米特组的p-smad2/3蛋白表达与高糖组相比有统计学意义（P<0.05），其作用呈一定的时间依赖关系。
　　 ⑵各组细胞分别培养24h、48h、72h、96h后流式细胞仪检测凋亡。与对照组相比，各组刺激24h细胞凋亡百分率无明显变化，高糖刺激48h后，细胞凋亡百分率开始显著升高（P<0.05），并且随着时间的延长而增加。与高糖组相比，来氟米特组及抑制剂组细胞凋亡百分率显著下降，其中来氟米特组较高糖组下降了（24±2.3）％（P<0.05）。总之，高糖刺激下足细胞表达p-smad2/3蛋白增加，且足细胞凋亡增加；与高糖组相比，加入抑制剂及来氟米特后，足细胞表达p-smad2/3蛋白均减少，且足细胞凋亡减少。
　　 结论：
　　 来氟米特能部分阻断高糖环境下smad通路所致的足细胞凋亡，减轻肾脏的硬化程度，其机制可能与减少TGF-β的表达阻止其激活smad蛋白从而阻止caspase家族诱导的细胞凋亡有关，进而延缓糖尿病肾病的进展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一章 材料和方法

第二章 结果

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述 糖尿病肾病的研究进展及治疗

作者简历

致谢