富含脯氨酸的酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮淋巴细胞中的表达及意义

摘要

目的：
　　 通过检测系统性红斑狼疮(SLE)患者淋巴细胞中富含脯氨酸的酪氨酸激酶（Proline-Rich Tyrosine Kinase 2，Pyk2）的表达水平，研究Pyk2在淋巴细胞增殖过程的作用，以及Pyk2对淋巴细胞中促进B淋巴细胞增殖的蛋白信号分子B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，Blys)的影响和在此过程中可能的作用通路，初步探讨Pyk2在系统性红斑狼疮发病过程中的意义，为系统性红斑狼疮发病机制的研究提供一定的实验基础，为临床用药提供一定的理论依据。
　　 方法：
　　 1、抽取SLE患者活动组、非活动组及健康对照组清晨空腹静脉血各20ml，采用密度梯度离心法，并用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞。
　　 2、采用免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR法，分别从蛋白分子水平、mRNA水平检测Pyk2在SLE患者和健康对照组成员外周血淋巴细胞(PBMCs)中的表达。
　　 3、在SLE患者和健康对照组成员外周血淋巴细胞(PBMCs)中分别加入促淋巴细胞增殖剂（佛波醇乙酸酯，PMA）和Pyk2特异性抑制剂（TyrA9）后，用CCK-8(Cell Counting Kit-8)方法检测PMA和TyrA9对淋巴细胞增殖的影响。
　　 4、在SLE患者和健康对照组外周血淋巴细胞(PBMCs)中分别加入促淋巴细胞增殖剂（佛波醇乙酸酯，PMA）和Pyk2特异性抑制剂，用半定量PCR方法检测淋巴细胞中小G蛋白(Rac1)及B淋巴细胞刺激因子(Blys)的表达水平。
　　 5、统计学方法：实验所得数据以均数士标准差表示，实验数据进行分析采用统计学软件SPSS13.0，各组总体上有无差别采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法分析，P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、免疫细胞化学法测定活化的Pyk2(Tyr402)在SLE中PBMCs的表达：磷酸化的Pyk2在健康对照组PBMCs中有少量表达，SLE患者活动组PBMCs中Pyk2(Tyr402)的表达水平明显高于SLE患者非活动组和健康对照组，而SLE患者非活动组PBMCs中Pyk2(Tyr402)的表达水平高于健康对照组。在PBMCs中Pyk2信号蛋白的表达和活化在SLE患者明显高于健康对照组。
　　 2、Pyk2mRNA的表达：与对照组成员相比，SLE患者PBMCs中Pyk2的表达水平明显升高。且SLE患者活动组和非活动组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，SLE患者活动组和健康对照组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，SLE非活动组和健康对照组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、PMA及TyrA9对淋巴细胞增殖的影响：PMA对于SLE患者及健康对照组PBMCs的增殖有促进作用。应用TyrA9后，SLE患者PBMCs的增殖受到抑制，而健康对照组成员PBMCs的表达水平无明显变化。
　　 4、SLE患者淋巴细胞中Blys和Racl的表达水平明显高于健康对照组。在三组PBMCs中加入PMA刺激后，SLE患者和健康对照组成员淋巴细胞中Blys和Rac1的表达水平均升高。而先应用Pyk2特异性抑制剂阻断Pyk2的活化后再加入PMA，SLE患者淋巴细胞中Blys和Rac1的表达无明显升高，差异无统计学意义。而对于健康对照组，应用TyrA9阻断Pyk2的活化后，PMA仍可刺激淋巴细胞的增殖，差异有统计学意义。可见TyrA9的抑制作用可能对于SLE患者淋巴细胞有特异性。
　　 结论：
　　 1、Pyk2可能参与SLE的发生发展，并且与SLE的病情活动性相关。
　　 2、Pyk2可能通过作用于PBMCs的表达而影响SLE的发展，而Pyk2的异常表达对SLE具有特异性。
　　 3、Rac1可能是Pyk2诱导SLE患者淋巴细胞增殖及活化的重要信号通路蛋白，Pyk2可通过诱导Rac1的表达而引起T淋巴细胞的异常增值和活化。
　　 4、Pyk2是PMA诱导SLE患者PBMCs增殖及促进Blys表达和活化的一个关键信号通路蛋白，在B淋巴细胞异常活化的过程中起关键作用。Pyk2可能通过作用于Blys而引起B淋巴细胞异常表达，从而进一步导致自身抗体产生增多，最终导致SLE的发病。
　　 5、Pyk2可能通过作用于Rac1而上调Blys及其受体，从而引起Blys的异常表达，进一步促进B淋巴细胞产生自身抗体，导致SLE的发病。

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正文

第一部分 富含脯氨酸的酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮淋巴细胞中的表达及意义

前言

研究对象和方法

结果

讨论

第二部分 富含脯氨酸的酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮发病过程中的作用

前言

研究对象和方法

结果

讨论

结论

展望

参考文献

附图与附表

综述

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致谢