兔角膜缘干细胞体外无血清培养及生物学特性研究

摘要

目的：
　　 在不添加血清（2％B27代替血清）的条件下对新西兰大白兔(New-Zealand Rabbit)角膜缘干细胞进行培养，观察所培养的干细胞的生物学特性，并与传统添加血清(浓度为10％)培养的兔角膜缘干细胞进行比较，进而探讨兔角膜缘干细胞体外无血清培养方法，为构建组织工程化角膜及角膜基础研究积累实验资料。
　　 方法：
　　 (1)无菌条件下获取兔角膜缘组织，采用酶消化法(DispaseⅡ)制成单细胞悬液，然后分别用含2％B27（无血清组）及10％胎牛血清（10％血清组）的DMEM/F12(1∶1)培养液稀释成等密度的细胞悬液。
　　 (2)将两组细胞悬液直接接种于培养瓶（倒置显微镜下观察两组细胞的生长情况）或96孔板(CCK-8检测其克隆增殖能力)。
　　 (3)原代培养至第3天、第5天行ANp63及角蛋白K3(AE5)免疫荧光染色，分别对培养的两组细胞进行干细胞鉴定并进一步进行比较。
　　 结果：
　　 (1)于倒置显微镜下观察可见含2％B27的无血清组培养的兔角膜缘干细胞表现出与传统含10％胎牛血清的10％血清组培养的角膜缘干细胞相似的生长特性。
　　 (2)CCK-8细胞增殖能力检测所得细胞生长曲线显示两组细胞表现出相似的增殖能力：对数增殖期大约在第3～5天，之后增殖缓慢进入生长平台期。
　　 (3)细胞免疫荧光染色显示含2％B27的无血清组培养的兔角膜缘干细胞中大多数细胞⊿Np63表达阳性而角蛋白K3(AE5)表达阴性，且与传统10％血清组培养的角膜缘干细胞相比，原代培养第3天⊿Np63表达阳性率相似(P＞0.05)，原代培养第5天⊿Np63阳性率略高(P＜0.001)。
　　 结论：
　　 (1)采用酶消化法可以成功分离获得兔角膜缘干细胞；
　　 (2)使用成分明确的B27代替血清可培养获得兔角膜缘干细胞，这大大减少了血清中不明成分对于细胞的影响，为角膜缘干细胞的体外培养、扩增及纯化提供了新的选择。