AMOC对癫痫大鼠脑内GABA、Glu、GAT1-P、EAAT1-P和ρ2mRNA表达的影响

摘要

目的：研究癫痫发作高峰期及终止发作后即刻、第1天、第2天、第3天和第7天脑内GABA（γ-amino-butyricacid，γ-氨基丁酸）、Glu（Glutamate，谷氨酸）、GAT1-P（γ-amino-butyricacidtransporters-1protein，γ-氨基丁酸转运体1蛋白）、EAAT1-P（Exactedaminoacidtransporters-1protein，兴奋性氨基酸转运体1蛋白）和GABAC受体ρ2mRNA表达的动态变化规律。分析AMOC（4-amino-2-methoxycantharidinimide，4-氨基-2-甲氧基斑蝥胺）对癫痫发作、痫性放电和大鼠脑内GABA、Glu、GAT1-P、EAAT1-P和ρ2mRNA的在7天内表达的动态变化的过程，探讨其发挥抗癫痫作用的机制。
　　方法：采用PNC（Penicillin，青霉素）诱发大鼠癫痫模型，灌胃AMOC（175mg·kg-1），30min后皮层注射PNC，记录脑电和痫性行为。分别在癫痫发作高峰期及终止发作后即刻、第1天、第2天、第3天和第7天定位海马区取材，测定下列指标：①免疫组化法测定脑内GABA、Glu、GAT1-P、EAAT1-P的表达情况；②实时荧光定量PCR（polymerasechainreaction，聚合酶链式反应）法测定同一脑区内ρ2mRNA的表达；通过与对照组进行比较和统计分析后得出结论。
　　结果：（1）大鼠运动皮层定位注射青霉素后，均出现Ⅰ~Ⅲ级发作，EcoG出现明显的棘波和棘慢波，与CON比较，差异均有显著性（P<0.05）。AMOC可明显延长癫痫发作的潜伏期，减轻发作程度，同时减少相同时间内痫样波发放频率，降低痫波最高振幅，与PNC组比较，差异均有显著性（P<0.05）。
　　（2）癫痫发作高峰期，脑内GABA表达稍降低（P>0.05），而GAT1-P表达增高（P<0.05）；癫痫发作终止末期，GABA和GAT1-P同时增高（P<0.05），两者在发作终止后1天逐渐下降，1-7天内两者的变化呈持续降低，且无反弹，但与正常对照鼠比较仍呈升高趋势（P<0.05），第七天仍未恢复到正常水平。给予AMOC后的发作高峰期，GABA的表达比PNC组明显降低（P<0.05)，而GAT1-P表达略高于PNC组；癫痫发作自行终止期及终止发作后1-7天内GABA和GAT1-P的表达变化与PNC组变化趋势相同，两者与PNC组比较均明显降低（P<0.05），但与正常对照鼠比较仍呈升高趋势（P<0.05）直到第7天恢复正常。（3）癫痫发作高峰期，大鼠脑内Glu表达明显升高（P<0.05），而EAAT1-P表达降低（P<0.05）；终止发作末期，Glu表达持续下降（P<0.05），而EAAT1-P呈持续增高趋势（P<0.05），与CON组比较均有显著性差异（P<0.05）。两者分别于终止发作后第3天、第2天逐渐恢复到正常水平，且无反弹。给予AMOC后，Glu表达比PNC组明显降低（P<0.05），而EAAT1-P明显与PNC组升高（P<0.05）；癫痫发作自行终止期及终止发作后1-7天内Glu和EAAT1-P的表达变化与PNC组变化趋势相同，分别于终止发作后第2天、第1天逐渐恢复到正常水平，比PNC组均明显降低（P<0.05），但与CON组比较仍呈升高趋势（P<0.05）。
　　（4）癫痫发作高峰期，大鼠脑内Glu/GABA明显增高（P<0.05），发作终止末期，比值逐渐下降，但仍高于CON组（P<0.05），发作终止后1天，比值持续下降至低于正常水平（P<0.05），自行终止后1-7天内，比值逐渐增加但未恢复到正常水平。给予AMOC后发作高峰期，大鼠脑内Glu/GABA比PNC组明显降低（P<0.05），但仍高于正常水平（P<0.05）；发作终止末期及终止发作后7天内比值变化与PNC组趋势相同，于终止后第3天恢复正常水平，无反弹。
　　（5）癫痫发作高峰期，大鼠海马区ρ2mRNA表达明显下降（P<0.05），自行发作终止期及终止发作后1-2天内ρ2mRNA表达呈持续下降趋势（P<0.05），第7天恢复正常。给予AMOC后的发作高峰期，ρ2mRNA表达略高于PNC组（P>0.05），终止过程中出现短暂升高后持续下降，至终止发作后2天逐渐回升至第7天接近正常水平。
　　结论（1）AMOC具有明显的抗癫痫作用。
　　（2）AMOC可增加脑内GABA的表达，促进GAT1-P表达，增加GABA向细胞外转运的功能，从而使突触间隙的GABA升高，增强CNS抑制性发挥抗癫痫作用。发作终止后7天内两者均逐渐恢复正常水平，但较正常组仍呈升高趋势，从而有效防止癫痫复发。
　　（3）AMOC可持续降低脑内Glu的表达，同时进一步增加EAAT1-P的表达，增加对突触间隙的Glu摄取，降低CNS兴奋性发挥其抗癫痫作用。发作终止后7天内持续下降Glu的表达，不断增强EAAT1-P的表达而增加对突触间隙Glu的清除而进一步降低CNS兴奋性有效维持癫痫抑制状态。
　　（4）AMOC通过降低Glu/GABA比值，从而提高癫痫发作阈值，减低大脑皮层兴奋性，使得GABA与Glu重新达到相对平衡状态而发挥抗癫痫作用。发作终止后1-2天，AMOC能够明显降低脑内Glu的表达，提高GABA的表达，表现出对Glu/GABA比例失衡具有明显的保护作用。直至发作后3天，AMOC使Glu/GABA比例恢复到正常水平。说明在癫痫发作终止后，AMOC能够很好逆转GABA功能减弱而Glu占优势的兴奋性毒性作用，继而维持兴奋性-抑制性平衡。
　　（5）AMOC在癫痫发作过程中通过短暂增加ρ2mRNA表达量，使GABAc受体上调而增强CNS抑制功能发挥抗癫痫作用。发作终止后1-3内ρ2mRNA表达量持续下降，直至第7天恢复到正常水平，但其幅度较正常组仍呈升高趋势，从而有效防止癫痫复发。

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前 言

材 料

1.动物

2.药品

3.试剂

4.仪器

方 法

1.建立PNC诱发的癫痫模型

2.动物分组及给药

3.观察指标

4.免疫组化法测定大鼠脑内GABA、Glu、GAT1-P和EAAT1-P的表达

5.测定大鼠脑内实时荧光定量PCR法中ρ2mRNA表达

结 果

1. AMOC对PNC诱发大鼠痫性发作和痫样放电的影响

2.癫痫发作过程中和终止后1-7天大鼠脑内各指标免疫组化测定结果

3.大鼠脑内癫痫发作过程中和终止后1-7天ρ2mRNA表达测定结果

讨 论

1.AMOC对脑内兴奋性通路（Glu、EAAT1-P）的影响

1.AMOC对脑内抑制性通路（GABA、GAT1-P、ρ2mRNA）的影响

3.AMOC对兴奋性/抑制性平衡的影响

结 论

参考文献

综述

攻读学位期间发表文章情况

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