再生基因1B(REG1B)对大肠癌细胞HCT116增殖、迁移及侵袭的生物学作用研究

摘要

目的：
　　大肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，全世界每年约有100万的新增病例，约有50万人死于大肠癌。在过去的几十年中，尽管通过早期筛查的诊断方法和治疗方式的改变降低了死亡率，但仍没有有效的方法提高患者的总体生存率。从分子生物学层面探讨大肠肿瘤发生、发展的机制是目前研究的热点，因此，发现靶基因治疗的新目标，尤其是那些对促进增殖和侵袭转移起明显作用的分子，是目前急需解决的问题。
　　1.探讨临床大肠癌组织标本中REG1B蛋白的表达，分布状况及其与临床因素的关系，并检测相关大肠癌细胞株sw480、sw620、HCT116中REG1B mRNA和蛋白质的表达。
　　2.构建靶向特异的REG1B干扰质粒并筛选出干扰效率较高的序列，为后续的研究打基础。
　　3.探讨REG1B基因干扰对大肠癌细胞株细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞迁移和侵袭转移等生物学行为的影响。
　　4.EG1B基因干扰后，用明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9的活性；利用免疫沉淀法研究REG1B与Il-6之间是否存在直接的相互作用，初步探讨基因沉默抑制大肠癌细胞迁移和侵袭的分子机制。
　　方法：
　　1.临床收集30例大肠癌组织和癌旁正常组织标本，制成石蜡切片标本。采用免疫组化方法检测这些标本中REG1B蛋白的表达及分布，分析它们的临床意义；采用Real time RT-PCR、 Western blot及免疫荧光方法检测大肠癌细胞株SW480、SW620和HCT116的REG1B蛋白质及mRNA的表达。
　　2.将3个REG1B的干扰序列连接到GV102载体上，之后测序检测干扰序列的正确性；利用脂质体2000转染HCT116细胞，并利用荧光显微镜、real time RT-PCR及western blot的方法检测REG1B的干扰效率，筛选出干扰效率最高的序列。
　　3.利用脂质体2000转染HCT116细胞，用细胞计数法绘制生长曲线、cck-8测细胞增殖的改变；利用流式细胞术进行细胞凋亡和细胞周的分析；用划痕擦伤实验检测细胞迁移的改变；利用Transwell小室检测REG1B基因沉默后，大肠癌细胞迁移和侵袭性的改变。
　　4.利用明胶酶谱法检测 REG1B基因沉默后 MMP-2和 MMP-9的活性改变；应用REG1B多克隆抗体对REG1B表达丰富的HCT116细胞总蛋白进行免疫共沉淀，然后再使用Western blot蛋白质杂交实验证实该复合物中是否有IL-6表达，接着用抗IL-6抗体行反向免疫共沉淀实验，证实该复合物中是否有REG1B，从而验证REG1B是否与Il-6存在相互作用的关系。
　　结果：
　　1.大肠癌组织中REG1B的蛋白质表达明显高于癌旁正常组织，REG1B的表达与大肠癌的分化程度有关；REG1B在HCT116、SW620及sw480中都有不同程度的表达，但HCT116和SW620细胞中的mRNA和蛋白质表达水平比sw480的水平高。
　　2.靶向特异的REG1B干扰质粒构建成功，3个干扰质粒对mRNA的干扰效率分别达到34.4％，84.2%，90%，其中第三个shRNA的抑制率最高。
　　3.REG1B基因的沉默可以抑制大肠癌细胞株的增殖，并使细胞出现G0/G1期阻滞，S期细胞百分比降低；凋亡检测结果显示，与对照组相比，REG1B的沉默，并不能增加细胞的凋亡；REG1B基因的沉默可以使大肠癌细胞株的迁移和侵袭明显减少。
　　4.明胶酶谱实验表明，REG1B基因沉默后可以使MMP-2和MMP-9的活性降低。应用REG1B多克隆抗体对REG1B表达丰富的HCT116细胞总蛋白进行免疫共沉淀，然后再使用Western blot蛋白质杂交实验，可以检测到IL-6的表达，同样用抗IL-6抗体行反向免疫共沉淀实验，复合物中也可以检测到REG1B。
　　结论：
　　1.REG1B蛋白质在大肠癌组织中表达升高，且与肿瘤的分化程度明显相关；REG1B在SW480、SW620和HCT116细胞中都有表达，但在SW620和HCT116中表达较高，由于HCT116细胞的转染效率较高，因此，被选为后续研究的工具。
　　2.成功构建并筛选出了REG1B的特异性靶向干扰质粒。
　　3.REG1B基因的沉默可抑制大肠癌细胞的增殖，而这一作用可能是通过影响细胞周期起作用的，而与细胞的凋亡无相关性。REG1B基因沉默后，细胞的迁移和侵袭转移能力降低，因此，REG1B具有促进大肠癌细胞迁移和侵袭转移的能力。
　　4.REG1B基因沉默可以降低MMP-2和MMP-9的活性并且REG1B与Il-6之间存在着直接的相互作用，因此REG1B促进大肠癌细胞的迁移和侵袭，可能是通过MMP-2、MMP-9及Il-6起作用的，REG1B可做为一潜在的基因治疗靶点。

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中文摘要

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前言

第一部分 大肠癌组织及细胞株中REG1B的表达

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第二部分 REG1B基因干扰载体的构建

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第三部分 REG1B基因干扰抑制大肠癌细胞恶性表型

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第四部分 REG1B促进肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

结论

讨论

参考文献

综述:再生基因1B与消化系统疾病

致谢

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