改良型大鼠脊髓损伤模型的探讨及丹酚酸B对脊髓损伤的干预作用

摘要

目的：
　　建立一种闭合性大鼠脊髓半离断损伤模型；在模型基础上探讨中药制剂丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）于损伤局部注射对大鼠脊髓损伤后细胞内信号通路的干预作用。
　　方法：
　　1.腰段脊髓损伤模型复制：SD大鼠6只，全身麻醉、无菌状态下，纵形切开背部皮肤及筋膜，在不打开椎板的前提下采用注射器针头制成的脊髓损伤器沿脊柱后棘突T9-T10间隙、紧靠棘突左侧垂直插入脊髓并向左侧做单向摆动和上下提拉，造成大鼠腰髓一侧（左侧）离断性损伤。通过观察脊髓损伤后大鼠左右侧后肢行走能力的比较、损伤局部形态学检测及损伤侧肢体的热痛反应、抓力测试等确定模型的复制成功。2.采用免疫荧光染色技术观察丹酚酸 B对大鼠腰段脊髓损伤后局部 PirB及Erk1/2表达的影响。SD雄性大鼠，220-250g。实验分为三组，每组5-6只大鼠。A组：为对照组，正常大鼠，不做任何处理。B组：单纯一侧腰段脊髓损伤组：按照模型复制方法复制腰段脊髓损伤模型，同时利用注射器针头所连接的注射器向损伤局部或脊髓腔缓慢注射0.9％生理盐水，30μl/只。C组：丹酚酸B用药组：一侧腰段脊髓损伤模型复制后，利用注射器针头所连接的注射器向损伤局部或脊髓腔内缓慢注射丹酚酸 B制剂，5mg/kg注射，总量30μl。各组动物在处理后分笼正常饲养，分别在24h、1周、2周后测后肢抓力。2周后取大鼠脊髓标本，处理后用免疫荧光法和Western blot法检测脊髓中PirB和ERK1/2蛋白的表达量。
　　结果：
　　用自制的注射器针头使大鼠脊髓损伤后大鼠出现明显的运动和感觉功能障碍。大鼠麻醉苏醒后即刻出现一侧后肢瘫痪、拖地行走，但无排尿及排便失禁，动物一般状态良好，后期未见合并感染。大鼠左后肢（患侧）对比右后肢（健侧）的抓力和热痛反应明显降低（p<0.05）。肉眼观察大鼠脊髓，术后24h大鼠伤口处肿胀，1周后伤口愈合，4周时背部皮肤基本恢复正常。打开脊椎椎板后可见针头插入部位位于腰髓段，此处脊髓仍充血肿胀，脊髓组织软化崩解。显微镜下观察（ HE染色）：术后大鼠脊髓的损伤区可见纵行脊髓纤维断裂，损伤区域内神经结构基本消失，髓鞘不可辨认。在大鼠脊髓损伤局部注射丹酚酸 B2周后，大鼠的左后肢抓力较损伤组大鼠有明显提高（p<0.05）。免疫荧光实验结果显示PirB大部分分布于脊髓前角灰质中。用药组较单纯脊髓损伤组PirB的表达显著降低（p<0.05）。免疫荧光实验结果显示，局部注射丹酚酸 B两周后，损伤侧脊髓 ERK1/2的表达较单纯脊髓损伤组有所升高（p<0.05）。
　　结论：
　　用自制的注射器针头造成的脊髓损伤模型操作简便、损伤较小、重复性好，并且因与注射器相连，可在造模同时局部给予药物/试剂进行干预，为探索脊髓损伤再生困难的分子机制提供了实验基础。丹酚酸 B可抑制 PirB的表达并激活 ERK的表达来促进大鼠脊髓损伤后的脊髓修复。

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前言

第一部分改良大鼠脊髓半离断损伤模型建立

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验器械

1.3 半离断SCI模型制备

1.4 观察指标

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 一般观察指标及感觉运动功能的测定

2.2 脊髓组织损伤的定位及一般形态学观察

第二部分丹酚酸B对脊髓损伤后PirB、ERK1/2表达的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂和仪器

1.3 动物分组处理

1.4 实验方法

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 丹酚酸B对于脊髓损伤后大鼠运动功能的影响

2.2 脊髓损伤后丹酚酸B对PirB表达的影响

2.3 丹酚酸B损伤局部注射对Erk1/2表达的影响

2.4 Western-blot蛋白印迹显示丹酚酸B对PirB表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述:脊髓损伤模型研究进展

致谢

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