有机锡化合物DBDCT对孕烷X受体(PXR)介导的CYP3A代谢酶的影响

摘要

目的：
　　进一步确证有机锡化合物二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡（DBDCT）对细胞色素P4503A（CYP3A）抑制作用机制。本文研究DBDCT对孕烷X受体（PXR）介导CYP3A表达的影响，分析PXR是否参与DBDCT对CYP3A的抑制过程，考察DBDCT是否可以引起核因子κB（NF-κB）的活化，以及NF-κB对PXR介导CYP3A表达途径的影响，探讨DBDCT是否可以通过活化NF-κB抑制PXR介导的CYP3A转录表达过程。
　　方法：
　　（1）利用双荧光素酶报告基因系统，研究DBDCT对PXR介导的CYP3A转录表达的影响；（2）采用Western blot方法分别对DBDCT作用前后的HepG2细胞全蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白进行检测，分析DBDCT作用前后NF-κB总量的变化及其在胞浆、胞核中表达量变化情况；同时，采用免疫荧光法研究DBDCT作用前后NF-κB由胞浆转运至细胞核内的情况，以研究NF-κB是否可以被DBDCT激活；（3）采用荧光定量PCR（FQ-PCR）方法和双荧光素报告酶实验，研究DBDCT激活的NF-κB对DBDCT作用后PXR介导的CYP3A转录调节途径的影响；（4）利用RNA干扰技术分别干扰PXR和NF-κB的表达，采用FQ-PCR方法检测DBDCT对HepG2细胞中CYP3A mRNA表达水平的影响，验证DBDCT对CYP3A的抑制过程与PXR和NF-κB的关系，进一步明确抑制作用的机制。
　　结果：
　　（1）DBDCT可以诱导人或大鼠PXR介导的CYP3A基因转录表达，且呈量效关系，与空白对照组相比，0.5μM、1μM和2μM的DBDCT作用24h可以通过rPXR诱导CYP3A1表达升高至1.37、2.06和4.34倍（p<0.05、p<0.001、p<0.001），以这三种浓度的DBDCT作用24h后hPXR介导的CYP3A4表达升高至2.16、3.72及4.86倍（p<0.05、p<0.001、p<0.001）；同时该诱导作用也存在良好的时效关系，以0.5μM的DBDCT分别作用24h、48h、72h，结果显示作用时间越长对PXR介导CYP3A表达的诱导作用越强。（2）Western blot法测得DBDCT作用前后细胞全蛋白中NF-κB的表达量未见显著性变化（p>0.05），但与空白对照组相比1μM和2μM的DBDCT可使细胞胞浆中NF-κB的表达量下降至0.70和0.61倍（p<0.01、p<0.01），使细胞核内NF-κB的表达量增至1.31和2.00倍（p<0.01、p<0.01）。免疫荧光法也证明DBDCT作用后NF-κB由胞浆转运至胞核，提示DBDCT可以活化NF-κB。（3）NF-κB的激活剂LPS可以使CYP3A4的mRNA表达水平明显下降；DBDCT也可以使CYP3A4的mRNA表达水平降低，且该作用可以由NF-κB抑制剂PDTC逆转。此外，在双荧光素报告酶实验中，向转染后的细胞中加入DBDCT可诱导CYP3A4表达升高，共转染时加入NF-κB质粒后该诱导作用被下调，下调程度随着NF-κB的加入量的增加而增加，共转染时加入NF-κB的抑制因子IκBα可以减弱NF-κB质粒对CYP3A4表达的影响。这些结果显示DBDCT对CYP3A4的抑制作用与NF-κB相关。（4）0.5μM、1μM和2μM的DBDCT对CYP3A4 mRNA的表达水平均有下调作用，与空白对照组相比表达量分别降低至0.75、0.64和0.44倍（p<0.05、p<0.05、p<0.01）。干扰PXR表达后，DBDCT对CYP3A4 mRNA表达具有更强的抑制作用。干扰NF-κB p65表达后，DBDCT对CYP3A4 mRNA表达的下调作用有所减弱。
　　结论：
　　（1）DBDCT可以通过PXR的调节诱导CYP3A表达；（2）DBDCT可以激活NF-κB，且所激活的NF-κB可作用于PXR介导的CYP3A4转录调节过程，下调CYP3A4的表达。

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常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 双荧光素酶报告基因系统研究DBDCT通过PXR介导对CYP3A的调节作用

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 DBDCT对NF-κB的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三部分 NF-κB的激活可以使CYP3A表达降低

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第四部分 利用shRNA技术干扰PXR、NF-κB验证DBDCT对CYP3A的抑制作用机制

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 有机锡化合物的应用及其毒性研究

致谢

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