探索家蝇幼虫抗菌肽粗提物抗FBL-3细胞的浓度和作用机制

摘要

目的：
　　1.本实验通过构建C57BL/6小鼠红白血病模型，得到更接近体内状态的原代FBL-3细胞，而众多肿瘤细胞实验均采用已传代的细胞株。红白血病动物模型构建的成功，是得到FBL-3原代细胞的重要前提。
　　2.将家蝇幼虫抗菌肽粗提物调整为不同浓度作用于FBL-3原代细胞，探索抑杀FBL-3原代细胞的最佳浓度。
　　3.在显微镜下，我们能够观察到大量的细胞碎片，并可以看到细胞质外涌。到底家蝇幼虫抗菌肽究竟通过怎样的方式起作用？将异硫氰酸荧光素（FITC）连接于抗菌肽，并作用于FBL-3细胞和另外一种肿瘤细胞MCF-7，经由激光共聚焦荧光显微镜观察来探索抗菌肽抑制肿瘤细胞的作用方式。
　　方法：
　　筛选适合构建模型的健康小鼠，构建红白血病动物模型。由于C57BL/6小鼠模型重复性好、周期短，因此适合于构建红白血病模型。我们选择了同种异体移植的方法构建模型。先将用于移植的FBL-3细胞复苏、培养。待到细胞对数期时，处理细胞并计数，将细胞浓度调整为2.25×106个/mL。将肿瘤细胞经尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内，随时观察小鼠精神状态，并触摸小鼠的淋巴结及胸腺处是否有肿块出现。处死模型小鼠，将肿块剥离，剪碎并研磨肿块，获得肿瘤细胞。将获得的细胞悬液转移入细胞培养瓶,于37℃、5％的CO2温箱中培养，观察细胞生长状况。
　　蘸取大肠杆菌，针刺诱导家蝇三龄幼虫，培养24 h。通过研磨，离心，固相萃取及真空低温冻干，获得家蝇抗菌肽粗提物。
　　将抗菌肽浓度依次调整为150、250、350、450μg/mL后作用于FBL-3原代细胞，培养24 h后在显微镜下观察细胞形态。利用台盼蓝染色，计算细胞的存活率。再经CCK-8试剂盒检测不同浓度抗菌肽作用下FBL-3原代细胞的细胞毒性，最后进行统计学分析。
　　用异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗菌肽后，作用于FBL-3细胞和MCF-7细胞，孵育4h。制作临时细胞标本，利用激光共聚焦荧光显微镜观察抗菌肽作用下的肿瘤细胞，以此来证实抗菌肽抗非实体瘤细胞FBL-3的作用机制。
　　结果：
　　采用同种异体移植的方法，可观察到约一周左右C57BL/6小鼠腋下长出肿块并蔓延到整个胸腺处，小鼠状态萎靡，之后经剥离处理的肿块可以培养出能够快速增殖的且可多次传代的FBL-3细胞。
　　经抗菌肽作用后，通过倒置显微镜观察，视野中出现了大量的细胞碎片，并可看到细胞质外涌迹象。经过台盼蓝染色，并计数，计算得到细胞存活率。随着抗菌肽浓度的增大，存活率呈先增大后减小的走向。随后，通过CCK-8试剂盒来检测不同浓度抗菌肽作用下FBL-3原代细胞的细胞毒性，经统计学分析，可知：各实验组与正常组相比较差异具有统计学意义（P<0.05）。250、300、350μg/mL，两两比较，差异不具有统计学意义（P>0.05）。细胞毒性随抗菌肽混合物浓度的增加先增大后减小，在300μg/mL作用下，其毒性最大。
　　抑杀FBL-3细胞的机制如何？我们通过抗菌肽和异硫氰酸荧光素（FITC）连接，利用激光共聚焦荧光显微镜，发现肿瘤细胞发出荧光绿。同时，还用连接了FITC的抗菌肽作用MCF-7细胞，验证了抗菌肽对MCF-7细胞有抑杀作用。
　　结论：
　　筛选健康的C57BL/6小鼠，采用同种异体移植的方法，经尾静脉注射FBL-3细胞，成功构建C57BL/6小鼠的红白血病模型，获得FBL-3原代细胞。
　　我们通过不同浓度的抗菌肽干扰从小鼠模型中获取的FBL-3原代细胞，发现抗菌肽对于FBL-3原代细胞的作用并不是随着抗菌肽浓度的增大而增强。将实验组按浓度分为150、200、250、300、350、400μg/mL组，300μg/mL组检测到细胞毒性最大。统计结果表明细胞毒性随抗菌肽浓度先增大后减小，300μg/mL达到峰值。从而，能够得到作用于FBL-3原代细胞的最佳浓度，为动物实验提供帮助。
　　家蝇抗菌肽能够抑杀肿瘤细胞，得到了再一次的证实。同时，探索得到了抑制 FBL-3细胞的最佳浓度。家蝇抗菌肽对非实体瘤细胞FBL-3和实体瘤细胞MCF-7都有抑杀作用，可通过溶解细胞膜进入细胞内，从而使细胞凋亡。
　　标记FITC的抗菌肽作用FBL-3细胞，并在荧光显微镜下观察到细胞呈荧光绿。在倒置显微镜下，经过抗菌肽作用后可看到大量细胞碎片，而且细胞膜上出现了裂隙。由此可以推断，抗菌肽通过细胞膜作用于肿瘤细胞，验证了抗菌肽通过破坏细胞膜抑杀肿瘤细胞的机制。

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前言

第一部分 构建红白血病模型获取FBL-3原代细胞

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 经过实验处理成功剥离腋下肿块，可看到肿块边缘相对整齐，未与周围组织发生粘连

2.2 在倒置显微镜下观察，经研磨处理的肿块细胞发生分散，在细胞培养箱中培养获得原代的FBL-3细胞

3 讨 论

第二部分 家蝇抗菌肽对FBL-3原代细胞增殖影响浓度的探索

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 倒置显微镜观察检测不同浓度抗菌肽混合物作用FBL-3原代细胞的结果

2.2 台盼蓝染色计算不同浓度作用下细胞的存活率

2.3 CCK-8检测不同浓度抗菌肽混合物作用下FBL-3原代细胞的细胞毒性

3 讨 论

第三部分 抗菌肽跨细胞膜杀伤肿瘤细胞作用机制的探索

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

综述:探索家蝇抗菌肽的抗肿瘤活性

致谢

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