家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物对原代FBL-3细胞作用机制的研究

摘要

目的： 1.利用家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物，来探究其对原代FBL-3细胞增殖周期是否存在影响。原代FBL-3细胞的获取是通过构建小鼠肿瘤模型来完成的。原代FBL-3细胞能够在生物学性能方面保持最佳状态，减少对实验数据的干扰。因此提取原代FBL-3细胞进行实验具有重要意义，能够提高实验的科学性。 2.研究家蝇幼虫抗菌肽粗提物是否通过细胞膜途径对原代FBL-3细胞发挥抑制作用。当家蝇幼虫抗菌肽作用FBL-3细胞后，在显微镜下可观察到细胞碎片，细胞质涌出，通过荧光素与抗菌肽连接来验证家蝇幼虫抗菌肽在抑杀FBL-3细胞时是否存在细胞膜机制。 3.抗菌肽抗肿瘤实验多是在细胞离体条件下进行的，抗菌肽在生物体内是否也能发挥作用值得去研究。利用原代FBL-3细胞成功构建了小鼠模型，进而为研究家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物在生物体内是否发挥作用提供前提条件。通过腹腔注射给药进行干预，观察家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物在模型小鼠体内的作用效果。 方法： 活化大肠杆菌并配制成实验所需浓度的菌液，2号昆虫针经酒精灯灼烧后伸入装有菌液的试管内，利用蘸有菌液的昆虫针去刺破已饲养好的三龄幼虫的体壁，进行抗菌肽的诱导。继续饲养至24 h后，将幼虫放入提前冷冻半小时的玻璃研钵内，加入配制好的溶液进行低温碾磨。将碾磨好的物质放入1.5 mL的EP管内，然后将低温离心机的模式设置为4℃、12000 r/min，进行30分钟的离心，重复操作2次。之后得到的上清液进行固相萃取，便可获得粗提取的家蝇幼虫抗菌肽。 对健康的C57BL/6小鼠进行挑选：雄性、体重在（20±1）g左右，构建小鼠肿瘤模型。待FBL-3细胞生长至对数增生期后，利用胰酶充分消化，终止后放入离心管内并用移液枪进行吹打，调整浓度制成实验所需的悬液。经右腋皮下注射到小鼠体内，约一周后可在小鼠右腋下方触摸到肿瘤团块，剥离瘤块提取原代FBL-3细胞，常规培养。 利用CCK-8、MTT实验检测家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物对FBL-3细胞毒力的大小，通过台盼蓝拒染的实验方法计算FBL-3存活率的高低。家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用于原代FBL-3细胞，调整其作用浓度并使之形成浓度梯度，通过实验结果计算得知原代FBL-3细胞在其不同浓度作用时的细胞毒力和存活率的大小。利用统计学方法对获得的所有实验数据进行分析。 利用流式细胞仪对经过家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物作用后的原代FBL-3的细胞增殖周期的分布情况进行检测。将荧光素与家蝇幼虫抗菌肽进行连接并作用于原代FBL-3细胞，通过激光共聚焦显微镜观察，证明是否存在细胞膜机制。 将家蝇幼虫抗菌肽经腹腔注射到构建模型成功的小鼠体内，根据注射剂量分为低剂量、中剂量、高剂量组，同时设置阴性对照组与阳性对照组，进行为期一周的干预。每天观察并记录小鼠的生存状况以及肿瘤的生长大小，一周干预结束后对小鼠颈椎脱臼进行处死，剥离肿瘤团块并进行称重，比较重量的大小并计算抑瘤率。 结果： 小鼠肿瘤模型的成功构建，为获取实验所需的原代FBL-3细胞提供了前提条件。原代FBL-3细胞具有最佳的生物学性能，得到的原代细胞能够快速增殖并能传代生长，为后续的实验提供了便利。原代细胞的成功获取，降低了FBL-3随传代次数增多导致的细胞活性不佳对实验数据正确性的干扰，提高了实验数据的可利用性。 CCK-8、MTT毒性试验和台盼蓝检测获得的细胞毒力及存活率确定了抗菌肽对原代FBL-3发挥作用的最佳浓度为300μg/mL。同时证明抗菌肽的作用强度存在浓度阈值的现象。当家蝇幼虫抗菌肽达到300μg/mL的浓度时，对FBL-3细胞的相对抑制率达到了最大为55.60％，当低于300μg/mL的浓度时，抗菌肽发挥的强度随作用浓度的增大而增强；当高于300μg/mL的浓度时，抗菌肽发挥的强度随作用浓度的增大而减弱。 细胞周期的检测结果为：原代FBL-3细胞经家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物作用之后，其增殖周期发生了不可逆的变化，处在G0/G1期的细胞比例出现上升，处在S期的细胞比例出现了下降。当恒定家蝇幼虫抗菌肽的浓度不变时，其对FBL-3的细胞增殖周期的作用效果是随着作用时间延长而增强的；当恒定家蝇幼虫抗菌肽的作用时间时，其作用效果是随着浓度的提升而增强的。说明家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物对细胞周期的作用存在剂量-时间依赖的特性。 FBL-3细胞经家蝇幼虫抗菌肽作用之后于显微镜下观察，镜下发现细胞破碎并成片漂浮，细胞膜出现孔洞导致内容物发生外涌。在激光共聚焦显微镜下可观察到，连接荧光素的抗菌肽侵入到了细胞内部，细胞发出荧光绿，说明抗菌肽破坏细胞膜使之出现了孔洞，以此进入到细胞内部。 将粗提取获得的家蝇抗菌肽经腹腔注射的方式注入到模型小鼠体内。实验结果表明抗菌肽低、中、高剂量组在小鼠体内对FBL-3细胞形成的肿瘤都具有一定的抑制作用，抑制作用的强度随着抗菌肽剂量的增大而增强，是一种剂量-效应关系，抑制率分别为36.25％、42.38％、48.64％。经家蝇幼虫抗菌肽干预的模型小鼠，生存状态较阴性对照组小鼠得到了明显的改观。 增殖周期的作用效果是随着作用时间延长而增强的；当恒定家蝇幼虫抗菌肽的作用时间时，其作用效果是随着浓度的提升而增强的。说明家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物对细胞周期的作用存在剂量-时间依赖的特性。 FBL-3细胞经家蝇幼虫抗菌肽作用之后于显微镜下观察，镜下发现细胞破碎并成片漂浮，细胞膜出现孔洞导致内容物发生外涌。在激光共聚焦显微镜下可观察到，连接荧光素的抗菌肽侵入到了细胞内部，细胞发出荧光绿，说明抗菌肽破坏细胞膜使之出现了孔洞，以此进入到细胞内部。 将粗提取获得的家蝇抗菌肽经腹腔注射的方式注入到模型小鼠体内。实验结果表明抗菌肽低、中、高剂量组在小鼠体内对FBL-3细胞形成的肿瘤都具有一定的抑制作用，抑制作用的强度随着抗菌肽剂量的增大而增强，是一种剂量-效应关系，抑制率分别为36.25％、42.38％、48.64％。经家蝇幼虫抗菌肽干预的模型小鼠，生存状态较阴性对照组小鼠得到了明显的改观。 结论： 1.家蝇幼虫抗菌肽的粗提取物对原代FBL-3细胞发挥作用时存在细胞周期机制，它能够阻滞细胞增殖周期进而使得FBL-3发生死亡。原代FBL-3的增殖周期发生了不可逆的变化，细胞处在G0/G1期的比例出现了升高，处在S期的比例出现了降低。 2.家蝇幼虫抗菌肽粗提物能够通过作用于细胞膜使其产生孔洞从而抑杀原代FBL-3细胞，其作用强度存在浓度阈值的现象。家蝇幼虫抗菌肽粗提取物的浓度达到300μg/mL时，它能够发挥最强的作用效果。 3.家蝇幼虫抗菌肽粗提物在模型小鼠体内能够明显地抑制肿瘤的生长，具有可观的抑瘤率，并能明显改善模型小鼠的生长状态。