慢性粒细胞白血病一种新剪接体ABLΔexon7+35INS的发现及其与TKIs耐药相关性研究

摘要

目的：酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）耐药问题在慢性粒细胞白血病（CML）患者的靶向治疗中受到越来越多的关注。本研究检测了健康人群及CML患者TKIs治疗有效组与耐药组中ABL基因剪接体ABLΔexon7和ABL35INS的表达情况，并依据融合基因断裂位点进一步设计新引物在初发 CML患者中分析各剪接体在融合型（BCR/ABL）和野生型（ABL）基因中的表达差异，并对其蛋白结构进行生物学功能分析，旨在探讨ABL基因的各剪接体与TKIs耐药发生的相关性，为阐明ABL激酶区点突变以外的TKIs耐药机制提供新的思路，为开发靶向药物提供依据。
　　方法：
　　1.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法结合PCR扩增产物直接测序法，在74例健康人和76例 CML患者（伊马替尼治疗有效组53例及耐药组23例）中检测ABLΔexon7和ABL35INS剪接体的发生率并进行统计分析。
　　2.依据BCR/ABL基因发生断裂融合的特点，设计新引物，在确定线性扩增循环数的前提下，以目的条带与 ABL总量的灰度比值作为各剪接体的相对表达量，在25例初发CML患者中检测并分析各剪接体在融合型和野生型ABL基因中的表达是否有差异。
　　3.对各剪接体在蛋白水平进行生物学功能预测与分析，在理论上探讨与 TKIs耐药的相关性。
　　结果：
　　1.发现并鉴定一种新的剪接体ABLΔexon7+35INS（ABLΔexon7和ABL35INS剪接体同时存在），该剪接体在对照组，治疗有效组和耐药组检出率分别为10.8％（8例），7.5%（4例）和8.7%（2例），统计学分析无差异。并且发现该新剪接体是ABL35INS剪接体的主要存在形式，发生率达到87.5%（14/16）。
　　2.这提示ABL35INS剪接体的发生往往会伴随外显子7的缺失，单一35bp插入的发生比例较少。
　　3.在74例健康对照组中检测到47例表达ABLΔexon7剪接体（63.5%），8例表达ABL35INS剪接体（10.8%），在53例伊马替尼治疗有效CML患者中检出30例表达 ABLΔexon7剪接体（56.6%），5例表达 ABL35INS剪接体（9.4%），23例发生CML耐药的患者中12例表达ABLΔexon7剪接体（52.2%），3例表达ABL35INS剪接体（13.0%），比较以上各组结果，无统计学差异。
　　4.在25例初发CML患者中检测分别转录自BCR/ABL融合型和ABL野生型的ABLΔexon7+35INS、ABLΔexon7和ABL35INS三种剪接体的相对表达量，经统计分析显示均无明显差异。
　　5.剪接体ABLΔexon7+35INS、ABLΔexon7和ABL35INS蛋白结构功能域相似，最终可能编码了同一种蛋白质。
　　结论：
　　1.首次在CML患者中发现一种新的剪接体ABLΔexon7+35INS，国内外尚未见报道。ABL35INS剪接体的发生往往会伴随exon7的缺失。
　　2. ABL各剪接体可以转录自BCR/ABL融合型中，也可以转录自ABL野生型中，二者表达无明显差异。
　　3.剪接体ABLΔexon7+35INS、ABLΔexon7及ABL35INS可能与CML患者TKIs治疗引发的耐药无明显相关性。

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前言

1材料与方法

1.1研究对象

1.2分组

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5主要试剂配置

1.6实验方法和步骤

1.7统计学处理

2结果

2.1最佳线性扩增循环数的确定

2.2 ABLΔexon7+35INS剪接体的发现：

2.3 ABLΔexon7、ABL35INS及ABLΔexon7+35INS剪接体在各组中的发生率：

2.4 BCR/ABL和ABL基因中各种剪接体表达的差异：

2.5剪接体ABLΔexon7+35INS生物学结构分析：

3讨论

4结论

参考文献

综述:慢性粒细胞白血病TKIs耐药机制及治疗新进展

致谢

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