海马内注射Exendin-4改善β淀粉样蛋白诱导的小鼠昼夜节律紊乱及机制研究

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）作为一种常见的神经退行性疾病，临床上主要表现为认知、学习、记忆等功能进行性下降。深入研究发现，25~40%的AD患者同时伴有不同程度的昼夜节律紊乱症状，主要表现为睡眠-觉醒周期紊乱、日间过度思睡和夜间烦躁不安，这些症状会加重患者的认知行为障碍，严重影响患者的生活质量。AD主要的病理特征为老年斑（Senile plaque，SP）在神经元间隙的沉积、神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFTs）和神经元的丢失。β淀粉样蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）作为老年斑的主要成分，具有明显的神经毒性作用。研究发现，伴有Aβ沉积的APP/PS1转基因AD小鼠（Transgenic mice with five familial Alzheimer's disease,5×FAD）表现出明显的昼夜节律紊乱现象。但针对Aβ是否可以直接引起小鼠出现昼夜节律紊乱的研究却较为少见。 针对AD的治疗药物层出不穷，但其治疗效果却不尽人意。大量研究表明，II型糖尿病（Type II diabetes mellitus，T2DM）与AD在发病机制和发病过程上关系密切。T2DM的新型治疗药物—Exendin-4不仅具有控制血糖的作用，还能发挥显著的神经保护作用。但Exendin-4对Aβ引起的昼夜节律紊乱是否具有保护作用仍不清楚。 因此，本课题的研究目的：(1)观察Aβ31-35对C57BL/6小鼠昼夜节律的影响，并同时观察其对小鼠海马区时钟蛋白CLOCK蛋白的影响；(2)观察Exendin-4对Aβ31-35引起的小鼠昼夜节律紊乱的影响，并观察Exendin-4预注射对小鼠海马区CLOCK的表达的影响，探讨Exendin-4对Aβ31-35引起的昼夜节律紊乱的改善作用。 目的： 利用小鼠跑轮行为学实验探究Aβ31-35对C57BL/6小鼠昼夜节律的影响，并用western blot方法检测Aβ31-35对小鼠海马CLOCK蛋白表达的影响。 方法： 健康雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组和Aβ31-35组，Control组小鼠双侧海马区注射8.2μL三蒸水，Aβ31-35组小鼠双侧海马区注射8.2μL Aβ31-35（15 nmol）。实验开始第1周小鼠处于12 h/12 h光暗循环（Light-dark cycle，LD），随后将光照条件改为持续黑暗（Dark-dark，DD），利用VitalView小鼠跑轮装置，监测各组小鼠的运动状况。2周后将实验数据导出，利用ActiView软件分析每只小鼠的在DD环境中的自由运转周期（Period）、振幅（Amplitude）、节律鲁棒值（Robustness）和平均每小时运动量（Locomotive activity）。 黑暗条件下，在不同的CT时间点处死各处理组小鼠，取下海马，加入组织裂解液，冰上剪碎匀浆后，离心，取上清，BCA法测蛋白浓度，计算上样量。加样，电泳，转膜，封闭，洗膜，加一抗，洗膜，加二抗，洗膜，曝光。Image J分析图像条带的灰度值，计算不同CT时间CLOCK蛋白的相对表达量。 结果： 持续黑暗环境中，Control组小鼠运动存在稳定的昼夜节律，休息相和运动相分界清楚，运动主要集中在主观夜间；Aβ31-35组小鼠运动的昼夜节律较不稳定，休息相和运动相分界不明显，主观白天运动增加，主观夜间运动减少。Control组小鼠自由运转周期为23.51±0.05 hr，昼夜运动振幅为127±14.06圈，节律鲁棒值为54.71%±2.55%，Aβ31-35组小鼠自由运转周期为23.63±0.05 hr，昼夜运动振幅为90.44±18.85圈，节律鲁棒值为22.47%±4.28%，其自由运转周期显著延长（P<0.05），昼夜运动振幅显著降低（P<0.05），昼夜节律的稳定性下降（P<0.05）。Control组小鼠平均每小时运动量为1167.63±130.28圈，Aβ31-35组小鼠平均每小时运动量为652.02±148.71圈（图1-10），Aβ31-35组平均每小时运动量显著下降（P<0.05）。 Control组小鼠海马区CLOCK蛋白表达存在明显的节律性，且在CT8和CT20时表达增高，CT2和CT14时表达降低。给予Aβ31-35后，海马区CLOCK蛋白缺乏节律性，缺乏表达的峰值和谷值，与Control组相比蛋白的表达趋势差异明显。 结论： 海马内注射Aβ31-35可导致C57BL/6小鼠出现明显的昼夜节律紊乱，说明Aβ31-35对机体具有显著的毒性作用，可破坏昼夜运动节律。深入分析发现，Aβ31-35可以引起海马区时钟蛋白CLOCK表达异常，这说明Aβ31-35可能是通过促使时钟蛋白的表达异常，发挥该神经毒性作用。 目的： 从行为学角度观察Exendin-4对Aβ31-35引起的昼夜节律紊乱的影响；从时钟蛋白表达的角度，进一步分析Exendin-4对神经系统的保护作用。 方法： 将 C57BL/6小鼠随机分组：Exendin-4预处理组和 Exendin-4单独给药组。Exendin-4预处理组小鼠双侧海马内注射1.6μL（50 pmol）Exendin-4，15分钟后注射8.2μL（15 nmol）Aβ31-35；Exendin-4单独处理组小鼠双侧海马区注射1.6μL（50 pmol） Exendin-4，15分钟后注射8.2μL三蒸水。将小鼠置于LD环境中，1周后将光照条件调整为DD，观察2周，分析小鼠跑轮运动的自由运转周期、振幅、节律鲁棒值和平均每小时运动量。 DD环境2周后，黑暗环境下，于不同的CT时间点取下小鼠的海马，提取组织蛋白后，利用Western blot实验检测海马区CLOCK蛋白的含量。 结果： 预先海马给予Exendin-4后，小鼠的运动存在昼夜节律，休息相和运动相存在明显分界，运动集中在主观黑夜。Exendin-4预处理组小鼠的自由运转周期为23.57±0.07 hr，昼夜运动振幅为125±19.43圈，鲁棒值为49.34%±3.76%，与Aβ31-35组相比，自由运转周期显著缩短（P<0.05），昼夜运动振幅显著增加（P<0.05），昼夜节律的稳定性提高（P<0.05）；与Control组相比，自由运转周期、昼夜运动振幅、昼夜节律的稳定性无明显差异（P>0.05）。Exendin-4预处理组小鼠平均每小时运动量为796.46±190.75圈，高于Aβ31-35组（P<0.05），低于Control组（P<0.05）。单独给予Exendin-4后不会改变小鼠的昼夜运动分布、自由运转周期、振幅、鲁棒值、平均每小时运动量（P>0.05）。 海马预注射Exendin-4后，小鼠海马CLOCK蛋白表达节律性部分恢复，在CT8，CT20时表达增高，CT2时表达降低，与Aβ组相比蛋白表达存在显著差异。单独给予Exendin-4后并不会改变海马区CLOCK蛋白的正常表达趋势。 结论： 海马内预注射Exendin-4后，Aβ31-35引起的运动节律紊乱可以得到部分恢复，说明Exendin-4可以部分拮抗Aβ31-35的神经毒性作用。深入研究发现，Exendin-4可以通过调节CLOCK蛋白的表达来发挥其神经保护作用。