Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用

摘要

目的:
　　1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK。
　　2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVtk）自杀基因的真核表达载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。
　　3.研究由survivin启动子介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦（GCV）对肝癌细胞的体外杀伤作用。
　　方法:
　　1.体外培养HL-7702人正常肝细胞、HEK293T人胚肾细胞、HepG2及HuH-7人肝癌细胞。
　　2.提取HepG2细胞的基因组DNA，PCR扩增survivin启动子序列；构建重组载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK并进行测序，通过BLAST对DNA序列的同源性进行比对；将该质粒载体转导入大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR扩增HSVtk基因，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
　　3.用重组质粒pcDNA3.1-pSurvivin-TK分别转染HL-7702、HEK293T、HepG2及HuH-7细胞，48小时后提取细胞总RNA及总蛋白，经RT-PCR法及Western blot法检测HSVtk基因在mRNA及蛋白水平的表达情况。
　　4.重组质粒pcDNA3.1-pSurvivin-TK被转染到HL-7702、HepG2及HuH-7细胞中，48小时后，加入梯度剂量GCV处理，MTT法检测HSVtk/GCV自杀基因系统对细胞存活率的影响。
　　5.质粒载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK转染HL-7702、HepG2及HuH-7细胞后，加入150μg/ml GCV处理24小时，Hoechst33258染色法检测细胞核形态变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧（ROS）水平；通过Caspase-3染色法在荧光显微镜下观察细胞内活化caspase-3水平。
　　结果:
　　1.通过PCR扩增得到survivin启动子序列，构建由survivin启动子介导的重组质粒载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK，测序得DNA序列与GenBank中的HSVtk序列相同，重组质粒载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK成功构建。
　　2. RT-PCR法及Western blot法检测结果表明，HSVtk基因在HepG2及HuH-7细胞中表达明显，而在HL-7702、HEK293T细胞中均未见HSVtk基因的表达。
　　3. MTT法检测得知，随着前体药物GCV剂量的升高，HepG2及HuH-7细胞存活率逐渐下降，与空白组相比，具有显著统计学差异（P﹤0.05），而HL-7702细胞未见明显杀伤作用。
　　4.通过Hoechst染色法分析，转染质粒pcDNA3.1-pSurvivin-TK的 HepG2及HuH-7细胞在GCV处理后，其细胞核颜色发白呈致密浓染且染色质固缩，而HL-7702细胞的细胞核未见明显改变。
　　5.流式细胞仪检测得知，经HSVtk/GCV自杀基因系统处理的HepG2及HuH-7细胞，其细胞凋亡率及细胞内活性氧水平显著升高，与空白组相比差异具有统计学意义（P﹤0.05），而HL-7702细胞凋亡不明显，且活性氧水平也未见明显变化。
　　6. Caspase-3染色法表明，HepG2和HuH-7细胞经HSVtk/GCV自杀基因系统干预后，荧光显微镜观察可见大量红色荧光，即caspase-3明显增多，而HL-7702细胞未见明显凋亡。
　　结论:
　　1.成功构建了一种新型的真核表达质粒载体pcDNA3.1-pSurvivin-TK。
　　2. HSVtk自杀基因在HepG2和HuH-7细胞内成功表达，而在HL-7702、293T细胞内未见表达。
　　3. HSVtk/GCV自杀基因系统对HepG2和HuH-7肝癌细胞有特异性的显著杀伤作用，而对HL-7702细胞未见显著杀伤。
　　本课题为国家自然科学基金项目“乳糜微粒定向介导TK基因载体系统对肝癌杀伤作用（编号:81172136）”。