基于CRISPR/Cas9的Wnt信号调控系统及其在提高MSCs心肌损伤修复能力中的价值

摘要

目的：
　　构建基于CRISPR/Cas9的Wnt信号通路调控病毒系统；探讨该调控系统对MSCs向成纤维、成血管、成肌等方向分化的调控；寻找能够提高MSC治疗心肌损伤的策略。
　　方法：
　　（1）基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其验证效果
　　选取Wnt信号中负性调控分子，设计并合成能够表达靶向上述分子gRNA的互补DNA克隆序列，BsmBI限制性内切酶酶切载体后，采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgRNA-Ms2-zeo，测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293T细胞；转染24h后收集细胞，qRT-PCR检测目的基因的表达。
　　（2）基于CRISPR/Cas9的Wnt信号通路调控病毒系统对MSCs分化命运的影响。
　　选取Wnt信号中负性调控分子的表达载体，通过Lipofectamine2000与psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞，48h后收集病毒并过滤，通过polybrene感染小鼠MSCs，感染72h后抗生素筛选，体外扩增，7天后，qRt-PCR检测各目的基因的表达。
　　结果：
　　（1）基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其验证效果。
　　筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因；针对每个基因设计了两对gRNA序列，并构建了能够表达gRNA和MS2融合序列的载体，测序结果显示重组质粒的 DNA序列与预期完全相符。随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞，qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达。
　　（2）基于CRISPR/Cas9的Wnt信号通路调控病毒系统对MSCs分化命运的影响。
　　慢病毒感染MSCs3天后，进行抗生素筛选，体外扩增后qPCR结果显示实验组VEGF、α-SMA、Col1a1均不同程度低于对照组（p<0.05）。Western blot结果观察到与对照组β-actin相比较α-SMA、Col1a1均不同程度降低。
　　结论：
　　1.本研究构建了基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的、可以精确调控Wnt信号通路的融合表达载体。
　　2.基于 CRISPR/Cas9的 Wnt信号通路调控病毒系统可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路来改变MSCs分化命运；为改善其心脏损伤修复功能提供了候选策略。

目录

常用缩写词中英文对照表

前言

1 冠心病心肌梗死流行病学及治疗现状

2 干细胞治疗的选择

3 Wnt信号通路及其与心肌纤维化的关系

4 CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术

第一部分 基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其效果的验证

1材料试剂与主要仪器设备

2 实验方法

3 结 果

4 讨 论

5 结 论

第二部分 基于CRISPR/Cas9的Wnt信号通路调控病毒系统对MSCs分化命运的影响。

1 材料试剂与主要仪器设备

2 实验方法

3 结 果

4 讨 论

5 结 论

6 本文小结

参考文献

综述：Wnt信号通路与MSCs分化方向的研究进展

致谢

个人简介